论文标题：Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.
本篇文章发表在HEPATOLOGY上，该期刊是美国肝病学会（AASLD）会刊，肝病领域顶级期刊，目前影响因子13.246。HEPATOLOGY属于临床杂志，所以上面发表的论文侧重于临床转化，该刊可能更加看重研究内容对肝胆医学的意义，也就是兼顾创新及应用，而对于机制挖掘没有传统基础医学学术刊物要求那么高，总体来说，该杂志需要一定的创新性及较完整研究证据链，和一定的转化应用潜能。
研究背景
环状RNA（circRNA）代表一类新的内源性非编码RNA，可调节哺乳动物的基因表达。不同于用5’末端和3’末端终止的线性RNA，circRNAs是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环状结构的非编码RNA分子。circRNA是保守和稳定的，并且许多circRNA似乎在细胞类型或发育阶段被特异性表达。细胞类型或发育阶段特异性表达模式表明，circRNA可能在许多生理和病理生理过程中起重要作用。天然内源性circRNA本身对外切核糖核酸酶衰变具有抗性，并含有选择性保守的微小RNA（miRNA）靶位点。因此，circRNA可以作为有效的miRNA海绵（miRNAsponge），与miRNA相互作用来调控基因表达。几乎每个生物过程都对miRNA的调节异常和功能进行了广泛的研究，然而，新鉴定的circRNA在特定生物活性中的表达谱和功能仍需进一步研究。
目前，已经证实circRNA参与发育过程、细胞功能的调节、心脏病的发病机理和神经变性疾病，如阿尔茨海默病的发展。在癌症发生和发展的研究中，就像miRNA广泛参与癌症一样，肿瘤发生和发展中的表达谱和circRNA在癌症发生和发展中的作用引起了广泛的关注。最近，已经发现某些种类的circRNA在胃癌、结肠直肠癌和食管鳞状细胞癌中显著失调，这些失调的circRNA被认为参与癌症发展。这些研究结果表明，circRNA可能是一种新的潜在生物标记和癌症治疗靶点。然而，在癌症研究中，阐明失调的circRNA和识别其功能仍然是一个持续的进程。
肝细胞癌（HCC）是广泛的癌症相关死亡世界的主要原因之一，特别是在中国。只有30％〜40％的HCC患者适用于治愈性切除术，部分原因是症状晚期出现，并且由于转移和复发率高，这些HCC患者的预后仍然很差。这些挑战导致迫切需要识别预后预测的潜在生物标志物，并找到新的目标来设计更有效的治疗方法。在过去十年中，许多非编码RNA（包括miRNA）和长非编码RNA已被发现在HCC患者中表达失调，这些在临床中具有潜在的应用价值。然而，HCC中circRNA的表达谱、功能和失调仍有待确定。
在本文中，先通过分析HCC组织中circRNA的表达谱，确定了HCC组织中的circRNAcircMTO1（hsa_circRNA_0007874/ hsa_circRNA_104135）显着下调，并且与HCC患者的预后密切相关。通过研究发现circMTO1可能作为致癌miR-9的海绵起到上调p21表达的作用，从而抑制HCC的发展。因此，circMTO1的减少可以作为预后预测的生物标志物，并可作为HCC患者潜在的治疗靶点。
实验及结果
1、HCC肿瘤组织中失调的circRNA和下调的circMTO1
利用circRNA芯片分析HCC组织（7个样本）和匹配的非肿瘤肝脏组织（7个样本）样本中上调和下调的基因，根据在组织中的表达丰度排序，选择10个上调和10个下调最多的基因（如上两张图）。
接下来在21个病人的样本中验证以上选定的circRNA的表达。其中作者只给出了其中6个结果（如上图）。在给出的6个结果图中发现只有circMTO1在HCC肿瘤组织中与芯片结果一致，且显著降低。（注：作者发现，虽然一些circRNA，包括circARID1B，circFAM13B和circFARP2在HCC组织中降低，但初步结果表明，这些circRNA的沉默对HCC细胞生长没有显着影响（数据未显示），只有沉默circMTO1对促进HCC细胞增殖具有重要作用。）
为了进一步的验证circMTO1的表达下降，作者又选用了另外261个病人的组织样品进行验证，如下图，结果显示，与匹配的非肿瘤组织相比，circMTO1表达在87.4％的（261例中的228例）HCC组织中明显降低。
以上结果显示，HCC组织中circMTO1降低的百分比高，引起作者重视circMTO1在HCC发展中的生物学意义。
第一部分结束：为了检测在HCC肿瘤组织中circRNA的表达情况，作者首先用circRNA芯片检测了肿瘤组织与正常组织中的circRNA的表达情况，筛选出10个表达升高和降低幅度最大的。在另外的6对组织中验证表达，发现只有circMTO1在HCC中HCC肿瘤组织中一致和显着降低。大样本的验证进一步证实circMTO1表达显著降低。
第一部分可以总结为筛选目的circRNA。
2、circMTO1表达降低与HCC患者的不良预后有明显的相关性
结合临床数据发现，取116名HCC病人的样品，经过原位杂交分析显示，与匹配的非肿瘤组织相比，circMTO1表达在HCC组织中也显着降低。
另外，HCC组织中circMTO1的表达减少与HCC患者的预后差异显着相关，如以circMTO1表达中值作为临界值的Kaplan-Meier存活曲线所示，相对于circMTO1表达高的病人，circMTO1表达低的病人存活率显著降低。
此外，作者还使用R软件中的K自适应分区统计（kaps）算法来计算circMTO1表达（76.89）的最有效的临界值，这可以最显着地区分这些HCC患者的结果。
以上数据表明，circMTO1在HCC中的表达降低与患者预后不良有关，circMTO1表达值为76.89可能有助于HCC患者的预后预测。
第二部分结束：作者使用临床样品进行检测，并结合临床数据，发现HCC中的circMTO1表达降低与患者预后不良相关。
第二部分可以总结为结合临床数据验证目的基因与患者预后的相关性。
3、在HCC细胞中circMTO1与miR-9相结合。
目前的研究表明，circRNAs主要作为miRNA海绵结合功能性miRNA，然后调节基因表达，接下来，通过生信分析筛选出与circMTO1相关的潜在miRNA。
通过miRandaProgram预测，99个miRNA被预测并列为circMTO1的可能靶标。以上为预测的相关miRNA。
为了捕获可能与HCC细胞中的circMTO1相互作用的功能性miRNA，使用circMTO1特异性探针进行体内沉淀（RIP），以鉴定与靶circRNA实际结合的miRNA。通过circMTO1特异性探针纯化了与circMTO1相关的RNA，然后筛选了之前由miRandaProgram预测的潜在miRNA。
根据预测出99个相关miRNA，目标主要着重于表达和功能与HCC有关的miRNA，主要筛选和分析了20种miRNA。通过RIPcircMTO1下拉实验，纯化circMTO1相关的RNA，并分析复合物中的20个候选miRNA。与对照相比，发现circMTO1只和miR-9特异性富集。而其他miRNA没有富集。
通过FISH分析在HCC肿瘤和匹配的非肿瘤组织中，发现circMTO1与细胞质中的miR-9共定位，与匹配的非肿瘤组织相比，这种共定位在肿瘤中降低。
这些结果表明circMTO1可以结合细胞质中的miR-9。
第三部分结束：在该部分中，作者为了确定与circMTO1相结合的miRNA，先使用生信分析，进行大致筛选，然后在根据筛选得出的miRNA的功能进行进一步的筛选，接下来进行RIP实验，确定了与circMTO1相结合的miRNA。最后通过FISH实验，验证并发现circMTO1与细胞质中的miR-9共定位。
第三部分可以总结为通过生信分析筛选与靶circRNA相结合的miRNA，RIP进一步筛选，FISH进行验证。
4、circMTO1抑制HCC细胞增殖和侵袭
接下来，作者研究了circMTO1在HCC发展中的作用。
为了选择用于circMTO1沉默或过表达的HCC细胞系，检测8个HCC细胞系中circMTO1和miR-9的表达。 SK-Hep1细胞circMTO1表达最低、miR-9表达最高，QGY-7701细胞中这两种RNA表达量中等，HepG2和SMMC-7721细胞circMTO1表达较高、miR-9表达较低。
构建siRNA，覆盖circMTO1的反向剪接区域以进行沉默。用circMTO1siRNA转染到HepG2和SMMC-7721HCC细胞后，通过qPCR测定和确定circMTO1沉默的效率。
circMTO1亚型2（has_circRNA_0132266）和MTO1mRNA的表达在circMTO1siRNA转染后没有显着变化，证实了circMTO1沉默的特异性。
此外，再构建带有环状框架和circMTO1序列的circMTO1过表达质粒（pCD-circMTO1），发现在QGY-7701和SK-Hep1HCC细胞中circMTO1可以显着过度表达。
circMTO1的沉默在HCC细胞中进行以确定其对HCC进展的影响并且研究其与miR-9的相互作用。通过在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达miR-9（上图A），发现，circMTO1沉默显着促进细胞增殖（上图B），增强细胞侵袭能力（上图C），减少HepG2和SMMC-7721细胞凋亡（上图D），circMTO1过表达促进QGY-7701和SK-Hep1细胞凋亡（上图D）。此外，miR-9过表达影响了circMTO1在HepG2和SMMC-7721中沉默的促肿瘤效应（上图B-D）。
为了验证circMOT1的miRNA海绵功能，检测了miR-9的表达，发现circMTO1对miR-9的表达水平没有影响。
这些结果表明circMTO1抑制HCC发展可能是海绵活性减少miR-9的致癌作用。
第四部分结束，在该部分中，作者先确定合适的细胞系，构建了相应的knockdwn和overexpress细胞，通过qPCR和westernblot验证。再此基础上，研究circMTO1对HCC细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响，同时也检测miR-9的变化，最终得出结论：circMTO1抑制HCC发展可能是海绵活性减少miR-9的致癌作用。
第四部分可以总结为，knockdwn和overexpress目的基因，检测该基因对细胞的影响以及潜在机制，即，对目的基因的作用机制提出猜测。
5、circMTO1通过对miR-9的海绵活性和p21的上调抑制HCC生长
为了研究circMTO1是否通过对miR-9的海绵活性发挥其抗肿瘤效果，首先，检测miR-9的靶标抑癌蛋白p21的表达。
如上图，circMTO1的沉默或miR-9mimic的转染均显着降低了HCC细胞中p21的mRNA和蛋白质表达水平。此外，circMTO1的过表达可以增加QGY-7701和SK-Hep1肝癌细胞中p21的mRNA和蛋白表达水平。这些结果表明，circMTO1可能通过保护p21免受miR-9的下调来发挥其抗肿瘤作用。
为了在功能上确认circMTO1通过对miR-9的海绵活性抑制HCC发展并因此上调p21，使用miR-9抑制剂来检测circMTO1沉默的肿瘤促进作用是否可以被miR-9敲低所阻断。如上图所示，miR-9抑制剂可显着降低circMTO1沉默后p21mRNA和蛋白表达的下调。
miR-9抑制剂显着阻断了circMTO1沉默介导的促进HCC细胞增殖和抑制凋亡的作用。因此，miR-9抑制剂可以阻断circMTO1沉默的HCC促进作用。
这些数据证明circMTO1作为miR-9海绵通过circMTO1/ miR-9 / p21轴抑制HCC发展以消除miR-9致癌作用。
第五部分结束，该部分作者首先沉默circMTO1和过表达miR-9（miR-9mimic）所得到结果均一致；接着，过表达circMTO1，所得到的结果与沉默circMTO1结果相反；然后，使用miR-9抑制剂（miR-9inhibitor）处理沉默过circMTO1的细胞，发现miR-9抑制剂的处理可以使沉默circMTO1的效果逆转；在后续的对增殖以及凋亡的实验中结果与前面实验一致。
第五部分可以总结为对目的基因作用机制的验证。
6、circMTO1的肿瘤内敲除增强了体内HCC的生长
最后一部分，进行活体实验。
对小鼠进行连续瘤内注射胆固醇结合的circMTO1siRNA两周后，发现携带HCC的SMMC-LTNM小鼠的肿瘤生长显着加速并且血清AFP显著增加。
瘤内注射胆固醇结合的circMTO1siRNA 48小时后，SMMC-LTNM小鼠的肿瘤组织中circMTO1和p21的表达显着降低。
此外，p21和下游CDK2表达被体内circMTO1敲低抑制，而细胞侵袭和增殖标记MMP2和PCNA上调。
因此，这些结果表明circMTO1可抑制体内HCC发展。
第六部分，该部分为活体实验，对小鼠进行连续瘤内注射胆固醇结合的circMTO1siRNA，实验结果与体外实验相一致。
第六部分可以总结为活体实验验证。
结论
本文首先确定研究方向为HCC中的circRNA，HCC病人样本表达谱分析结果表明，HCC病人中circMTO1显著下调，结合病例分析得出结论：circMTO1表达降低与HCC患者的不良预后明显相关。接下来RIP筛选出circMTO1与miR-9相结合发挥miRNA海绵（miRNAsponge）的作用，从而抑制miR-9，使miR-9不能对其目的基因p21进行负调控。活体瘤内给药knockdowncircMTO1可使HCC发展加速，与体外实验以及临床数据结果一致。
总的来说，circRNAMTO1作为miR-9的海绵，抑制肝细胞癌的发展
本文思路总结：
结合临床样本确定目的基因，目的基因与病的相关性，筛选与目的基因相互作用的基因（或蛋白），进一步筛选与目的基因相互作用的基因（或蛋白）调控的基因（或蛋白），体外实验进一步验证。
参考来源：Han D, Li J, Wang H, et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.[J]. Hepatology, 2017, 66(4):1151.
作者:SnioScript在线/微信公众号
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