非编码RNA中，miRNA作为科研者的新手之友，可帮助大家跨过科研初级门槛。但学海无涯，科研亦无止境，要想攀登科研高峰，单靠miRNA还略欠些火候。而长链非编码RNA（lncRNA），这朵带刺的玫瑰，无疑是大家科研冲刺的另一大助力，则本策“革故鼎新”就讲一讲lncRNA的研究套路。

不同于数量偏少、机制简单的miRNA，基数庞大的lncRNA作为细胞功能的调控中枢，其机制研究复杂多变，实打实是分子变量中的真正主角，近年来也是备受科研者的追捧。而circRNA严格意义上应该是lncRNA的一个特殊亚类，只不过因其数量庞大而自成一派。既然lncRNA和circRNA同气连枝，那么只要搞清楚了lncRNA自然就解锁了circRNA。

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初接触lncRNA，必然会对其五花八门的命名方式感到头晕目眩。其中，以其功能、定位、调控对象命名的lncRNA大有所在。而就其类型而言，可分为以下几类：

反义（antisense, AS）lncRNA，即一类从编码基因反向转录的lncRNA，在哺乳动物中占了20%，可调控附近基因的转录。

内含子（intronic, IT）lncRNA，则是在基因内含子区域编码的lncRNA。

重叠（overlapping, OT）lncRNA，是跨越内含子和外显子的lncRNA。

长链基因间lncRNA（lincRNA），其编码区域位于两个基因中间，不与编码基因的内含子和外显子重叠。一般以大写LINC为前缀，数字为后缀。

反义上游（Antisense upstream, AU）lncRNA，与编码基因是头对头挨着（head to head），推断可双向启动子，一般会在lncRNA后缀AU字母。

eRNA（enhancer lncRNA），是由基因的增强子编码产生的，作用是促进基因转录。

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而circRNA没有线性mRNA的5’端帽子结构和3’末端有poly（A）尾，呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，可稳定存在于细胞中。

circRNA由mRNA特殊可变剪切产生的，在很多情况下会有一个同源表达的基因，但其表达却与同源基因表达不相关，是受到胞内特别调控的。circRNA的表达水平具有种属、组织、时间特异性，序列保守性比一般的线性lncRNA高。

它主要存在于细胞质中，大部分来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中，是正常细胞功能以及疾病发生、发展中重要的参与者。绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数跟lncRNA一样可以翻译出多肽片段。

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其实，研究lncRNA的前置动作也是筛猜分子。当所筛选的分子研究中还没有报道，那么首当其冲要做的就是验证该分子是否编码蛋白。

通常在Noncode（www.noncode.org）数据库中查询该分子序列后，可用NCBI的ORF finder来预测该序列是否具有超过100个碱基长度的ORF（开放阅读框）。在预测到了氨基酸序列后，以Blast分析检测其同源蛋白，如果检测不到则说明该序列不表达蛋白，是lncRNA。

此外，还可通过CSF（密码子替换频率）来计算一段序列编码的密码子在不同物种之间的保守性，并以此分析非编码RNA序列特性。因非编码RNA保守性差，当CSF评分小于0的时候，则该序列也被证实为lncRNA。

至于circRNA，除了证明它本身不编码蛋白，还需要证明它是环状的。果然，玫瑰有刺会扎手。那么如果大家没有足够科研实力和经费预算，也可挑选文献中已有报道的分子进行老分子套新表型研究，基于表型相关性的原则，再以通量解决概率问题，可降低lncRNA的研究难度。

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做完这些后，可套用单变量研究的5个步骤：基础表达、操作工具、细胞表型、动物表型和Rescue。

检测基础表达时，以实时定量RT-PCR检测RNA水平，也可用FISH（荧光原位杂交）进行lncRNA的亚细胞定位。值得注意的是，因lncRNA表达一般比mRNA低，在前面筛选过程中，优先选择表达量高的；最好用送测序或者芯片的同一批样品来做二次验证，如果换一批样品，批次之间也有分子表达的差异，验证效果就会差一些。

制备基因操作工具时，因RNAi主要在细胞浆发挥作用，那么可用CRISPR基因编辑技术将核定位的lncRNA基因给knockout掉。随后再进行细胞、动物水平的“一正一反”表型实验验证。

至于表型的Rescue实验，就功能基因而言，可基于密码子的简并性——密码子第三位的变动，使得每个氨基酸对应至少2个密码子——导入一个突变的过表达载体，让蛋白的氨基酸序列保持不变，而mRNA却序列可以发生改变，从而使过表达和siRNA干扰这两个操作相互独立。

但miRNA和lncRNA却是不做自身Rescue的。除了不编码蛋白外，还因为miRNA序列短，一旦突变就会发生功能变化，容易造成实验的假阳性；lncRNA与蛋白结合关键的序列可能就不到十个碱基，万一正好突变在关键位置，也会给实验带来干扰。

所以通常只会将CRISPR敲掉后的细胞重新过表达lncRNA分子，以此来进行lncRNA的Rescue验证。另外，考虑到miRNA的靶基因编码蛋白，则miRNA的Rescue策略可自然转化成回复它靶蛋白的表达。

总之，虽然lncRNA、circRNA的作用机制很多样，但主要有3种作用方式：1）miRNA分子海绵（miRNA sponge），像海绵一样吸引结合miRNA；2）调控基因转录，跟转录因子关系密切；3）编码小肽。后续的课程也会一一进行详细讲解，带领大家接近基础研究的高次元空间，掌握分子横向展开的各种逻辑规律和思路

作者：子非鱼

文章出处：酸谈  微信公众号