文章：生信草堂（微信公众号）

01 前 言

今天和大家分享一篇经典的综述，题目是 Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges ，为circRNA研究提供一些参考。circRNA是一类新兴的非编码RNA，具有特殊的拓扑结构和稳点保守 性，而成为研究热点。

文章发于Nature Reviews Genetics (if ~ 40) 是早期比较经典的综述文章 http://dx.doi.org/10.1038/nrg.2016.114。作 者综述了实验和生信分析中识别circRNA可能出现的偏差，举例并加以讨论。同时提出circRNA在识别上还存在一些问题：

1. 虽然已有多种算法支持circRNA的识别，但是缺少对假阳性和假阴性率的评估。

2. 对于剪切位点的选择以及RNA过程的模型还不够。

02背 景

环状RNA的backsplices 大多数发生于注释的外显子边界上或者包含经典的剪切信号的位置 (spliceosome)。

大多数的环状亚型 (isoforms) 只能产生1-2个可区分的circRNA，但是也有个例。

大部分细胞中的circRNA丰度在2-4%左右，当时有些细胞类型中也会有较高水平。

已在从人类到小鼠、果蝇、蠕虫、简单的生物如真菌、植物中均检测到了circRNA，对比亿万年的进化，circRNA表达不仅保守而且经历多次独立进化。

虽然circRNA mini-gene包含核糖体嵌入位点 (IRES)启动翻译，但是非编码是circRNA普遍的规律。

03 识别剪切过程中的挑战

精确的剪切位置比对识别。

使用注释可以提高识别的精确度。

注意一些circRNA包含A-rich序列，因此对poly(A)+ RNA文库测序结果需要通过算法过滤低表达的mRNA 转录本。

04 识别circRNA中的挑战

· 实验

1. circRNA没有poly(A)尾巴，可以通过此特征进行纯化。

2. 由于RNA测序片段大小的选择，只有在接头扩增前，RNA没有被打断的情况下，可能会影响circRNA的识别。

3. 反转录模板可能会导致technical artefacts，产生假阳性。

4. 长同源序列会促进模板转换 (template switching), 对于基因产生多个共享同构外显子 (constitutive exons) 的亚型来说是一个很严重的问题。

· 生信分析

1. 单向测序可能导致反向剪切位置的来源的误判。

2. 外显子附近的简并序列产生同源性和测序错误可能导致假阳性。

3. 对于线性剪切的探测可以增加识别的敏感对，但是实际上导致了高假阳性率。

05 环状RNA识别算法的比较

双端测序、更高的读取范围可提高识别敏感度，更多样本重复、RNase消化线性RNA以及统计方法将降低假阳性。

· 不同的算法过滤机制及高可信度子集的选择标准会导致不同的结果。

· 一些无参识别circRNA的算法为了降低假阳性，只选取唯一映射的读段并检测经典的剪切位点，来排除已知的circRNA isofroms。例如find_circ，三方评估结果发现，其具有较低的敏感性并且可能会有很多假阳性报告。

· 使用相同的模拟数据，所有的算法显示可以通过增加读数 (read count)来提高敏感度但是同时会降低其识别的特异性 (specificity)。

· 套索结构 (lariat)与circRNA相似，具稳定性以及不受RNase R影响，因此也作用为circRNAs的识别标记。所有算法中，circRNA的识别少于0.17%可能与套索相联系。

Table 1 Filtering criteria for selection of high-confidence circRNAs

06 验证circRNA识别的讨论

· RNase R treatment

处理后的样本在识别circRNA时，可以确认假阳性的识别结果。但是在处理的过程中，可能会导致部分在文库准备过程中断裂的基因被消化，而这些被消化的基因无法判断是否与circRNA的形成相关。

对比两个文库的数据时，归一化处理比较更具有意义。

· depletion in poly(A)+ libraries
circRNA不具有poly(A)尾，但是在 poly(A)+ 文库中可能也存在着一些circRNA，它们通常表达水平低下。因此，当只有单个预测的circRNA在 poly(A)+ 文库出现，并不足以证明其正假阳性。

· decoy reads

对于circRNA来说，decoy reads 包括map到反向可变剪切上的和map到被定义为反向剪切的基因区域中的两种。由于实验以及比对方法上可能产生的人工片段干扰circRNA识别，例如外显子同源性等，decoy reads 应该选用合适的模型进行预测，并且提供统计学分值来控制假阳性。

· RT specificity

尽管缺乏RT特异性可以提供circRNA真阳性的证据，但是该实验方法无法从人工产物中区分出circRNA，可能导致高的假阳性，需要进一步实验验证。

· simulated data

模拟数据对于算法的系统局限性具有较好的评估，但是较于实验数据来说，由于生物化学事件并不完全知晓，因此模拟数据的复杂程度不及RNA测序数据。

Table 2 Methods used to assess the genome-wide accuracy of algorithms

07 建议统计检验

对于真实数据的全基因组假阳性circRNA的鉴定，对比RNase消化后的残余量指标相比，poly (A)文库中circRNA的竭尽 (depletion) 指标更合适。

对多个重复的数据进行表达分析时，每一个重复必须分别分析标准误差。支持双端测序数据进行circRNA表达的量化。

08 旁证：功能性分析

来自许多基因的高表达circRNA也具有保守性。

独立于线性转录本表达水平，circRNA具有活跃的调控模式。

09 小 结

作者从测序准备文库以及算法两个方面对circRNA的鉴定进行讨论。在文库准备上应该将circRNA尽可能的富集，例如去线性去核糖体RNA；在识别上对接头序列的真阳性和假阳性进行分类。有参识别可以进一步的提高识别精度，但是无参也会提供一系列新鉴定RNA的信息，例如非经典剪切信号等。RT模板在扩增上可能出现”人造”干扰，在算法上应该加以避免。同时强调统计方法的合理使用可以提高识别的真阳性。同时总结了circRNA识别算法的现状以及不同实验处理下对circRNA识别的影响，为深入circRNA研究提供了参考依据及建议。