环状RNA cSMARCA5在肝癌中抑制癌细胞的生长和转移

Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma

期刊：Journal Of Hepatology

影响因子：12.486

作者单位：第二军医院

背景和目的：近年来，环状RNA（circRNAs）被发现在肿瘤生物学中发挥着重要的调控作用。然而，环状RNA在肝癌（HCC）中发挥的作用在很大程度上依然未知。

方法：cSMARCA5（一个产生于SMARCA5基因15号和16号外显子的环状RNA，hsa_circ_0001445）通过RNA测序识别，并被qRT-PCR（定量实时PCR）证实。 cSMARCA5在HCC中的作用通过体内和体外实验进行评估，包括circRIP（环状RNA体内沉淀实验）、荧光素报告基因测定实验、生物素偶联microRNA捕获实验和FISH（荧光原位杂交实验）等去评估cSMARCA5与miR-17-3p/miR-181b-5p之间的相互作用。

结果：DHX9（DExH-Box Helicase 9）是高丰度的核RNA螺旋酶，在HCC中，由于DHX9的上调表达，cSMARCA5的表达下降。在肝癌组织中，cSMARCA5的下调与侵袭性特征显着相关，并且是肝癌切除术后肝癌患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的独立危险因素。体内和体外实验表明，cSMARCA5抑制肝癌细胞的增殖和迁移。从机制上看，作者发现cSMARCA5通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p来促进TIMP3（一种肿瘤抑制因子）的表达。

结论：这些结果揭示了cSMARCA5在HCC生长和转移中的重要作用，并为肝癌研究进展中的circRNA作用提供了新的视角。

总结：cSMARCA5是一种环状RNA，抑制HCC的生长和转移，有望成为HCC的潜在治疗靶点。

01\通过RNA测序，在人肝组织中识别环状RNA

抽取肝癌组织（HCC）、周边组织（ANL）及健康肝组织RNA，建立环状RNA文库并进行测序，发现有4727个circRNAs，其中4214个circRNAs（89.15%）已经在circBase得到识别（图1-A）；进一步发现，4142个circRNAs来源自2322个基因的外显子（图1-B），这些circRNAs的长度大部分小于1000 nt（图1-C）。对比HCC文库及ANL文库可知，这些识别到的circRNAs中有236个circRNAs有差异表达，其中包括108个在HCC中上调表达，128个存在下调表达（图1-D），部分circRNAs的差异表达情况通过qRT-PCR得到鉴定（图1-E）

图1

02\cSMARCA5在HCC中的特征

作者选取了cSMARCA5进行研究，这个circRNA来源于SMARCA5基因的15号和16号外显子（图1-A）。该circRNA在HCC和ANL中差异表达的表达丰度最高（图1-B），它在HCC表达下调，但是其基因来源SMARCA5的pSMARCA5、mSMARCA5及蛋白的表达均上调，这暗示了，在HCC中下调表达的cSMARCA5不仅是剪接副产物，很可能发挥着功能。为了研究cSMARCA5的特征，通过随机引物和寡聚脱氧胸腺嘧啶RNA反转实验及RNaseR处理检测发现，cSMARCA5为不含poly-A尾巴的环状RNA（图2-C，D）；另外，半衰期结果表明了cSMARCA5比mSMARCA5更稳定（图2-E），并主要在细胞质中表达（图2-F，G）。综上所述，cSMARCA5为稳定的环状RNA，在HCC中有明显的差异表达。

图2

03\在HCC中，cSMARCA5的表达受到DHX9的调控

作者对cSMARCA5结构进行研究，发现SMARCA5的14号内含子和16号内含子有高度反向互补序列，为了验证这两端序列（I14RC和I16RC）是否促进cSMARCA5生成，作者分别构建cSMARCA5野生型载体（从SMARCA5基因的14号内含子到16号内含子）及两端片段截断载体，如图3-A，发现只有野生型载体能高表达cSMARCA5（图3-B），这说明了I14RC和I16RC不可或缺。

对RNA结合蛋白相关基因进行敲除发现，DHX9敲除后，cSMARCA5上调表达，但对pSMARCA5、mSMARCA5不受影响（图3-D）。而对敲除了DHX9的细胞分别过表达DHX9及其螺旋酶功能突变基因，过表达野生型DHX9的转化体中cSMARCA5表达水平重新受到调控，而功能突变的转化体中cSMARCA5不受影响，说明了DHX9对cSMARCA5的调控依赖其螺旋酶活性（图3-E）。同时，进行DHX9的RNA免疫沉淀，发现I14RC和I16RC被明显富集（图3-F）。此外，对HCC中的DHX9表达分析表明，DHX9在HCC中上调表达（图3-G，H），并在HCC组织中与cSMARCA5的表达负相关（图3-I）。

图3

04\cSMARCA5的下调表达预测肝切除术后HCC患者的临床病理学特征和不良预后

Kaplan-Meier生存曲线显示，cSMARCA5表达较低的HCC患者总生存率（OS，P = 0.0004）和无复发生存率（RFS，P = 0.0008）较差（图4-A，B）。cSMARCA5表达水平与甲胎蛋白、肿瘤大小、病理卫星、包裹一起进行多变量分析，表明cSMARCA5表达水平是OS的独立危险因素，并且cSMARCA5表达水平与甲胎蛋白，肿瘤大小，微血管侵入，包裹一起进行多变量分析，表明cSMARCA5表达水平是RFS的独立危险因素（图4-C，D）。

图4

05\在体内及体外实验中，cSMARCA5抑制HCC的生长及转移

在HCC细胞中过表达cSMARCA5，CCK-8实验、划痕愈合实验和Transwell迁移表明过表达cSMARCA5抑制HCC细胞的生长及迁移（图5-A-C）。裸鼠皮下注射结果表明，过表达cSMARCA5抑制HCC的生长，而原位植入肝内转移模型同样支持此结果（图5-D, E）。进一步通过尾静脉接种建立肺转移模型，结果表明过表达cSMARCA5有效抑制肺转移（图5-F, G）。

图5

06\cSMARCA5发挥海绵作用吸附miR-17-3p和miR-181b-5p

为了研究cSMARCA5作用机制，通过RNA免疫沉淀实验，以AGO2抗体下拉捕获到cSMARCA5（图6-A），表明了cSMARCA5作为AGO2和miRNAs的结合平台。作者接着通过软件筛选到29个有可能在HCC中跟cSMARCA5互作的后续miRNA，结合circRNAs 沉淀实验发现了两个高丰度miRNA，为miR-17-3p和miR-181b-5p（图6-B）。通过荧光素报告因子检测实验表明，miR-17-3p或miR-181b-5p与报告基因共转，报告因子活性减低（图6-C）；在cSMARCA5序列中突变与miR-17-3p或miR-181b-5p结合的位点后，与报告基因共转，报告因子活性增强（图6-D，E）。pull-down实验也证明了cSMARCA5与miR-17-3p、miR-181b-5p的互作（图6-F），并共定位于细胞质（图6-G，H）。综上所述，cSMARCA5吸附miR-17-3p、miR-181b-5p。

图6

07\cSMARCA5在HCC中通过参与miR-17-3p/miR-181b-5p- TIMP3途径抑制HCC的生长和迁移

作者通过检测cSMARCA5的过表达及敲除细胞系发现，TIMP3随着cSMARCA5表达水平上调而上升，下调而下降（图7-A, B），同样，在HCC与ANL组织中，TIMP3的表达水平与cSMARCA5表达水平正相关（图7-F, G）。进一步研究发现，当过表达miR-17-3p或miR-181b-5p时，TIMP3表达水平降低，而在此基础上过表达cSMARCA5能恢复TIMP3的水平，CCK-8实验同样证明了此结果（图7-C, D）。Transwell转移实验也证明了miR-17-3p/miR-181b-5p能促进HCC细胞的转移，而cSMARCA5的过表达能打破这种促进作用（图7-E），综上所述，cSMARCA5通过调控miR-17-3p/miR-181b-5-TIMP3途径，从而抑制HCC的生长和迁移。

图7

总结
cSMARCA5可以作为miR-17-3p/miR-181b-5的海绵分子，吸附miR-17-3p/miR-181b-5，从而消除癌症抑制因子TIMP3的抑制作用，但是在HCC中，DHX9的表达水平上调，抑制cSMARCA的表达，导致cSMARCA表达量下降，最终促进HCC的生长和转移。

图8

文章：永诺生物