作者：梦熊

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原文：一篇8分的circRNA做了哪些内容

就像老是后悔20年甚至10年前没有买房一样，很多人在lncRNA火了之后立马着眼于circRNA了，害怕错失良机。

今天来看一篇8分的circRNA研究吧。

来自于台湾国立成功大学医学院特聘教授蔡少正课题组，主要从事以下研究：

一、缺氧诱导因子(HIF-1α)调控基因与癌症抗药性之研究。细胞因为缺氧会产生种种不同的生理反应或病理变化，包括学习记忆、癌症、心血管疾病、生长迟缓、脑部疾病、肺部疾病等。我们利用生物信息学的方法，将基因体中会受缺氧诱导因子调控之基因（包括人类、大鼠、小鼠）找寻出来，并研究其在生理、病理上的功能，尤其着重在癌症抗药性方面的探讨，目前以大肠癌及胰脏癌的抗药性机制为重点；

二、研究整个基因体的调控及细胞分化、去分化及再分化的机制。表观基因体调控对细胞之命运影响至巨，甚或造成细胞病变。利用生物信息学、功能性基因体学、系统生物学等尖端方法，对此一现象作深入的研究；

三、探讨子宫内膜异位成因之分子机制。本实验室过去十几年的研究，在这个领域已有相当杰出的成果，居于世界领先地位，未来将着重在整合性基因功能上的研究，期盼能发展出可以治疗该疾病的方法或药物。

Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis. Cancer Res. 2017 Mar 1.

本文的第一作者是该课题组博士后萧贵阳。CircRNA CCDC66是一条非常新的circRNA，由CCDC66基因编码。课题组发现在息肉及结直肠癌中circCCDC66的表达是调控的，并且与预后状况呈负相关。体外实验表明，circCCDC66调控多个病理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭、锚定非依赖性生长。深入研究表明，circCCDC66通过调控多个肿瘤基因来实现上述功能。体内实验表明，敲减circCCDC66后能抑制肿瘤的增殖、侵袭作用。这表明，circCCDC66在肿瘤进程及转移过程起着重要的作用。

主要内容：

1、筛分子

课题组建了一套方法，以增加map率。

接着作者筛选了一些亲本基因参与调控细胞周期、信号传导、表观调控、转录调控的circRNAs作为后续研究。而其中CCDC66基因的转录生物学功能鲜有报道，所以课题组决定选择circCCDC66做进一步的研究。

2、验证

通过结直肠癌细胞株、乳腺癌细胞株、胰腺癌细胞株、宫颈癌细胞株实验发现，circCCDC66在肿瘤细胞中的表达上调了，这表明在肿瘤发生时circCCDC66表达普遍提升。另外，研究发现线性CCDC66在肿瘤中的表达要低于其对应的癌旁组织。

且证实了缺氧条件能降低线性CCDC66转录本的水平，而circCCDC66表达无显著变化。这说明瘤内的缺氧应激能促进circCCDC66积累循环，并且由于自身的稳定性能加强这种积累作用。

3、临床相关

首先，发现circCCDC66在癌前息肉组织中表达提升了，且在肿瘤组织中的水平更高。且在不同分期内，其在肿瘤中的水平都是高于癌旁组织。结合生存曲线，发现circCCDC66与不良预后相关。

且通过ROC曲线计算出AUC为0.88，这表明circCCDC66是CRC病人病情检测和预后的一个非常好的marker。

4、功能验证

研究组设计了特定的反向剪接点的siRNA，特异性敲减circCCDC66（对线性的CCDC66 mRNA无影响）后，肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显降低。

过表达circCCDC66能增加细胞的克隆形成，BrdU核素掺入法表明circCCDC66能刺激DNA合成。

circRNA和mRNA及lncRNA类似，均有吸附miRNA的功能。作者通过预测，发现有99个miRNAs与circCCDC66有结合位点，这暗示着在结直肠癌中circCCDC66可能保护着一些癌基因免受miRNAs的干扰。同时结合GEO数据库中3组数据显示，这99个miRNAs中有66个在结直肠癌中表达。

作者通过分析结直肠癌中有显著差异表达的癌基因及肿瘤抑制基因，结果发现有37.5%的肿瘤基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点，而仅有23.5%的肿瘤抑制基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点。

进一步实验表明，DNMT3B、EZH2、MYC、YAP1这些与预测miRNAs存在结合位点的蛋白，在circCCDC66过表达时其丰度显著上调了。而其中EFNA4、FGF9这两个与预测miRNAs无结合位点的分子，则不受circCCDC66表达变化的影响。

接着验证circCCDC66的miRNA sponge作用。将带有生物素的线性RNA环化，用环化后的RNA去pulldown miRNAs。结果显示，miR-33b、miR-93、miR-185三条被预测与circCCDC66存在结合作用的miRNAs被带有生物素的circCCDC66富集下来。另外，实验表明在过表达circCCDC66时，MYC（circCCDC66上调蛋白）其3′-UTR区活性增强（miRNAs吸附减少）。敲减circCCDC66后发现MYC mRNA表达显著减低。Rescue实验（加入miR-33b、miR-93抑制剂）后则能回复MYC mRNA水平。这些结果均表明circCCDC66能作为miRNA的海绵，调控MYC表达。

5、体内实验

体内实验表明，circCCDC66敲减后肿瘤在体内的生长水平受到了抑制。