转载：生信草堂

今天分享的文章题目为：Circular RNAs mediated by transposons are associated with transcriptomic and phenotypic variation in maize，文章发表于New Phytologist（影响因子7.33）。介于转座子在玉米中广泛存在，且驱动基因组变异，作者假设转座子可能参与circRNA的形成并进一步调控表型变异。

背 景

1.circRNA是一类共价闭合单链转录本，在真核生物进化过程中基因表达具有保守性。

2.circRNA由反向剪切环化形成，受到顺式作用元件和反式作用因子调控。

3.哺乳动物研究中发现，circRNA的侧翼区域富集转座子，可能可以通过反向互补配对的方式调控circRNA的形成。

4.转座子可以参与功能基因的表达和表型变异。并在人类转座子反向互补配对的研究中发现，其参与circRNA形成的调控。

5.泛基因组可以大幅度的显示基因组变异，包括CNVs (copy number variations) PAVs (presence/absence variations) 等。转座子作为主要的影响因素，在单倍型之间的差异很大，可能会导致circRNA多样性。

材料与方法

1. 公开数据库下载玉米的RNA测序数据 (kernels; SRP026161；seedings; SRP018753)，并通过生信手段进行circRNA的鉴定。鉴定软件主要使用KNIFE。

2. 以B73 植物的种子及V3阶段第三片叶子为组织材料，随机设计30对引物进行PCR验证。

3. 进行circRNA特征描述；psRNATarget 用于预测miRNA target；RepeatMasker 获得circRNA和转座子以及重复序列间的关系，并注释重复元件侧翼5‘和3’剪切位点；AGRIGO用于功能注释。

4. 通过荧光定量PCR探索LLERCP和表型变异之间的关系

结 果

1. 首先通过通过三个预测软件，过滤掉来源于两个转录本的circRNA，最终获得2804个外显子circRNA。并对不同工具预测得到的候选circRNA进行实验验证，每个方法选取10个独立的环状RNA进行实验验证，选取验证率高的CIRCexplorer2 (nine of 10) 和CIRI_annotated (seven of 10)以及KNIEF（只是提到在之前已经验证过了) 高可信度circRNA进一步分析。染色体定位发现，circRNA与基因一样，更常见出现于染色体的两端。

2. 其次作者探索了circRNA的特征，对比circRNA与其他线性RNA，得到以下结论（图）：

a. 前者显著更长；

b. 前者平均的外显子长度显著更短；

c. 前者接头位置的侧翼内含子序列显著较长；

d.虽然circRNA的表达浓度不高，前者却有较高水平的表达；

e. 较线性转录本，circRNA具有较多的miRNA结合位点；

f. circRNA更可能以组织特异性方式表达，而不是全基因组线性转录物。

3. 作者注释了35kb发生环化接头的上下游基因组序列，以找寻重复元件。总共找到了六个富集在circRNA接头附近侧翼序列的转座子，包含LLEs (LLERCPs), LREs (LRERCPs) and DLEs (DLERCPs)，其中LLERCPs, LRERCPs 和DLERCPs可能形成Watson-Crick茎环互补结构。作者挑选LLERCPs作为后续分析对象，并结合反转录转座子 LLEs进行分析，同时对比了与LLERCPs相关的线性和环状转录本的表达。

4. 作者总共挑选了51个circRNAs，其中包含LLERCPs相关和不相关。T检验发现，携带LLERCPs的基因组中circRNA浓度要显著高于不携带组。同时作者发现，只有在circRNA最近的侧翼内含子中包含着LLERCPs时，circRNA浓度显著高于无该结构组。随后作者对变异相关基因表达模式进行分析，但是没有得到LLERCPs的数目与线性和circRNA之表达差异的联系。

5. 由于LLERCPs在形成环状过程中可能出现茎环结构，作者分析了玉米中circRNA和small RNA的关系。茎环结构可以被切除用于small RNA的形成，也可以提供一个稳定的结构招募可以形成circRNA的剪切体。结果显示，circRNA的来源基因在24nt 25nt small RNA的浓度显著低于其他随机的基因，可以判断，LLERCPs可能可以作为形成circRNA过程中稳定的前体转录本(precursor transcripts)。

6. 随后作者验证了其与表型变异间的关系，主要做了以下工作（图）

a.GO富集：对照B73参考基因组，产生circRNA的基因更多参与细胞过程(P = 4.40E-14)。

b.GWAS：超过7500非冗余可探测到circRNA基因与表型变异相关。随机选择两组基因比较，可探测到circRNA的基因group中，接头相关位点显著高于未检测组；基因长度较长；与circRNA具有类似的侧翼内含子长度且具有相似的表达模式。说明可转录出circRNA的基因更可能参与表型变异。

c.GRMZM2G089149 （was significantly associated with ear height/ contains LLERCPs and accumulates a circRNA, circ1690,）PCR扩增结果显示，该基因包含14个外显子、13个内含子，circ1690包含第三个到第十一个外显子以及第二个到第十一个内含子（含LLERCP）；定量结果显示几乎所有的自交系GRMZM2G089149基因都包含LLERCPs且11个自交系的circ1690中包含的LLERCPs的浓度显著高于RCPLLEs，说明LLERCPs与circRNA的形成相关。同时circ1690的表达与GRMZM2G089149线性转录本的浓度呈负相关。但是作者并没有观察到穗高与线性或者circRNA转录本的关系。

小 结：文章主要通过 maize reference inbred B73 两周龄的幼苗叶子circRNA-Seq数据，分析玉米中circRNA的形成机制和潜在的功能。作者聚集玉米转座子对于circRNA形成的影响，发现LLES以及LLERCPs显著富集与circRNA的侧翼区域，并证明其生成的茎环结构可以招募转录本环化。然后根据前人研究结果，找到了一个包含LLERCPs转座子的基因，该基因控制穗高，比较线性转录本和环状转录本与该转座子的关系，得出其可能通过转座子驱动转录circRNA来调控表型变异的结论。

两篇文章同样发于NP，后者的分析的量更大，且更深。但是，优质期刊能再次刊登circRNA相关报道，证明circRNA已是研究的热点，并具有研究潜力，且植物中的研究尚有很大的空间。