神经调节蛋白1（neuregulin-1, NRG-1）是神经调节蛋白家族成员之一。NRG-1蛋白结构上含有表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）样的胞外结构域和高度保守的胞内结构域（intracellular domain, NRG-1-ICD）。NRG-1被基质金属蛋白酶水解后释放出具有生物活性的EGF胞外段；胞内段NRG-1-ICD则进入细胞核，通过与一些转录因子相互作用而调节基因表达；此外，NRG-1-ICD含有的LIM结构域还参与和胞浆蛋白的相互作用。许多研究表明，NRG-1在心血管生理及病理过程中都发挥重要作用。血小板源性生长因子BB（platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB）能够刺激血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化成合成型表型，使细胞增殖和迁移增加；而TGF-β1能够维持细胞分化呈收缩表型。在VSMCs中，NRG-1可抑制由PDGF-BB引起的细胞增殖和迁移。但是，TGF-β1诱导的VSMC分化是否需要NRG-1-ICD参与以及NRG-1-ICD如何调节VSMCs的功能目前尚无报道。
环状RNA（circular RNA, circRNA）是一种对真核基因表达具有调节功能的共价、闭合、单链RNA。circRNA可作为微小RNA（micro RNA，miRNA）的“海绵”竞争性结合胞内miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用，从而上调miRNA靶基因的表达。除此以外，circRNA也可通过与RNA结合蛋白(RNA-binding protein， RBP）结合，或者与其他RNA通过碱基互补结合而对特定基因发挥调节作用。目前关于描述VSMC中的circRNA表达调控和生物学功能的信息很少。本研究基于以上基础，以TGF-β1作为VSMC分化的诱导因素，首次证明NRG-1-ICD诱导的circRNA——circACTA2，通过与miR-548f-5p相互作用，从而释放miR-548f-5p对α-SMA的抑制作用。
结果
1. TGF-β1诱导VSMCs产生NRG-1，其胞内结构域参与细胞骨架组织
NRG-1 在正常动脉组织和 VSMC 细胞中表达丰富，而在内膜增生状态下表达减少（图1A，B）。WB 结果显示 TGF-β1以时间依赖性的方式上调NRG-1蛋白表达（图1C）。TGF-β1 处理后的 VSMCs 上清中，NRG-1β（NRG-1 的可溶性生物活性形式）增加，但 PDGF-BB 不影响 NRG-1β 水平（图1D，Online Figure IIE）。结果表明 TGF-β1 不仅诱导 NRG-1 表达，而且促进其被蛋白水解酶切割成活性形式。
接下来，在HASMCs细胞中用腺病毒过表达NRG-1，结果发现NRG-1可以促进肌动蛋白丝（actin filaments, F-actin）募集成肌动蛋白束，且能抵抗细胞松弛素（CB）诱导的解聚（图1E），表明NRG-1参与F-actin的形成并稳定其结构。作者进一步探究发现用NRG-1β处理细胞不影响肌动蛋白细胞骨架（Online Figure IIIA），但是过表达NRG-1-ICD细胞骨架则出现束状排列（Online Figure IIIB），表明NRG-1通过其ICD域介导细胞骨架组织。
进一步探究NRG-1-ICD参与细胞骨架的组织是否依赖于NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用。免疫荧光结果显示，TGF-β1 刺激HASMC 细胞后NRG-1-ICD 和 α-SMA的表达水平均上升，且共定位（Online Figure IVC）。免疫共沉淀，GST pull-down ，邻位连接技术（PLA）等实验结果进一步证实， TGF-β1 促进了NRG-1/NRG-1-ICD 和 α-SMA的结合（Online Figure IVA，IVB，图 1G）。这些发现表明 TGF-β1 可以直接促进NRG-1-ICD 与α-SMA 相互作用从而参与细胞骨架组织。
2. NRG-1-ICD通过与α-SMA基因的第一内含子结合而上调α-SMA表达
在TGF-β1处理后的细胞中观察到NRG-1-ICD发生明显的核易位（图1H）。结合染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），有65个与NRG-1-ICD差异结合的基因，α-SMA基因（也称为ACTA2）属于14个上调的基因之一（Online Figure VA）。对ChIP-Seq结果进行验证，结果发现TGF-β1促进α-SMA基因内含子区与NRG-1-ICD的结合（图1I）。构建NRG-1-ICD-binding site和NRG-1-ICD-binding site mut荧光素酶报告基因载体，与NRG-1-ICD表达质粒共转染后，观察到野生型NRG-1-ICD-binding site活性明显升高（Online Figure VC）。这些结果表明，NRG-1-ICD与α-SMA基因第一内含子区+5642 bp/+5787 bp结合（Online Figure VB）。NRG-1-ICD的过表达和敲低实验显示，NRG-1-ICD增加TGF-β1诱导后α-SMA的表达（图1J）。过表达鼠源NRG-1-ICD可以回复人VSMC敲降NRG-1-ICD后的表型（Online Figure VG），进一步明确 NRG-1-ICD通过与α-SMA基因的第一内含子结合而上调α-SMA表达。
NRG-1-ICD诱导新的circRNA，即circACTA2的形成：作者查阅数据库，发现α-SMA基因座可以产生4个α-SMA circRNA，而NRG-1-ICD 过表达不影响α-SMA mRNA 水平且能与α-SMA基因的第一内含子结合，推测NRG-1-ICD可能通过诱导circRNA生成上调α-SMA表达。验证发现扩增不出已知的4个α-SMA circRNA，但是他们发现一条全新的长度为730bp的circACTA2。
作者设计针对circACTA2的引物，以cDNA和基因组DNA为模板进行RT-PCR。结果显示， cDNA模板可以扩增出circACTA2，而gDNA模板则不能扩增出此片段（Online Figure VIA）。RNase R降解线性RNA后，α-SMA mRNA水平显著降低，对circACTA2的影响较小（Online FigureVIB）。northern印迹进一步证明了circACTA2来源于α-SMA基因的5号外显子至9号外显子的环化（图2A）。这些结果鉴定circACTA2为一个新的环状RNA
为了研究NRG-1-ICD是否可以影响circACTA2的形成：研究者用CRISPR interference（CRISPRi）技术，合成一段与NRG-1-ICD结合位点互补的单链gRNA，它通过介导 Cas9 酶切割α-SMA 基因第一内含子而阻断转录。结果显示，切断NRG-1-ICD结合位点后，circACTA2表达降低，而α-SMA mRNA没有变化（图2C）。TGF-β1和NRG-1-ICD单独或联合过表达增加circACTA2的表达，而NRG-1-ICD敲降消除了TGF-β诱导的circACTA2上调（图2D， Online Figure VIJ）。这些研究结果表明NRG-1-ICD通过与α-SMA基因的第一个内含子结合而介导circACTA2形成。
3. NRG-1-ICD通过募集IKZF1至α-SMA基因的第一内含子，诱导circACTA2形成
研究者通过生物素标记pull-down实验来寻找HASMC中与NRG-1-ICD结合序列相互作用的蛋白质，转录因子Ikzf1（Ikaros）、PHB2和ASCC3被募集。免疫共沉淀、两步法ChIP和PLA等实验显示，在TGF-β1处理的细胞中Ikzf1与NRG-1-ICD相互作用，TGF-β1增加了它们的相互作用（图2E-G，Online Figure VIIA）。这些结果表明NRG-1-ICD与Ikzf1形成稳定的复合物。
为了研究RNA结合蛋白Quaking（QKI）和RNA编辑酶ADAR1是否参与TGF-β诱导的circACTA2形成，研究者发现TGF-β1/NRG-1-ICD影响了QKI/ADAR1的表达，说明二者可能参与NRG-1-ICD诱导的circACTA2形成。（图2H）。QKI或ADAR1敲降后，circACTA2形成分别减少或增加，但α-SMA mRNA水平未受影响（图2I和2J）。这些数据表明QKI和ADARI影响NRG-1-ICD诱导的circACTA2形成。
4.circACTA2通过减少miR-548f-5p来上调α-SMA
为了确定α-SMA的表达和circACTA2之间的关系，我们设计两个siRNA，一个特异性敲低circACTA2（si-circACTA2），另一个是同时敲低环状和线状ACTA2（si-both）。结果发现，si-circACTA2不影响α-SMA mRNA水平；si-both时，会使circACTA2和α-SMA mRNA的水平均下降（Online Figure IXA）。在HASMC中，过表达或敲除circACTA2显著影响了α-SMA蛋白的表达（图3A）。表明circACTA2在TGF-β1/ NRG-1-ICD诱导的α-SMA表达中起重要作用，且circACTA2可能通过转录后水平调节α-SMA表达。
circACTA2与miR-548f-5p有相互作用：RNAhybrid和miRanda-based预测circACTA2能与miR-548f-5p互补结合。萤光素酶测定表明miR-548f-5p mimic显着降低由野生型circACTA2序列介导的萤光素酶活性（Online Figure IXE）。生物素标记的pull-down实验发现，二者相互富集（图3B和3C）。RNA原位杂交的结果发现circACTA2与miR-548f-5p共定位（图3D）。在内膜增生的肾动脉中，miR-548f-5p水平显着增加（图3E），而circACTA2表达及其与miR-548f-5p的相互作用在内膜增生的动脉中减少（图3F和3G）。人circACTA2过表达不能减少小鼠股动脉损伤引起的内膜增生（Online Figure XA and XB），可能由于circACTA2具有物种特异性。
α-SMA是miR-548f-5p靶基因：人α-SMA 3′-UTR含有miR-548f-5p-结合位点。萤光素酶测定证实了miR-548f-5p与α-SMA 3′-UTR的结合（图3H）。miR-548f-5p mimic和anti-miR-548f-5p降低或增加α-SMA蛋白表达（图3I）。TGF-β1刺激和 NRG-1-ICD 过表达都可以使 miR-548f-5p 的表达水平降低，二者联合时降低更为显著（图3J）。这些结果表明，circ ACTA2 可以作为分子“海绵”吸附 miR-548f-5p。
5. NRG-1-ICD / circACTA2 / miR-548f-5p轴调节HASMC收缩
si-circACTA2显着降低NRG-1-ICD过表达诱导的α-SMA表达，反之亦然（图4A）。miR-548f-5p沉默或circACTA2表达的变化影响α-SMA表达（图4C）故circACTA2和miR-548f-5p是NRG-1-ICD诱导α-SMA表达的关键介质。
过表达circACTA2或NRG-1-ICD、以及沉默miR-548f-5p可以增加乙酰胆碱（Ach）或去甲肾上腺素（NE）诱导的HASMC收缩（图4B和4D，Online Figure XIIC和XIIF）。结果表明circACTA2作为miR-548f-5p的分子海绵促进α-SMA表达，影响细胞收缩。
参考文献：Sun Y, Yang Z, Zheng B, et al. A Novel Regulatory Mechanism of Smooth Muscle α-actin Expression by NRG-1/circACTA2/miR-548f-5p Axis[J]. Circulation Research, 2017, 121(6):CIRCRESAHA.117.311441.
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