作者：BioWorld

circRNA领域研究最近很火，但基本都集中在海绵（sponge）作用上，难免有些审美疲劳。也有少数circRNA可以编码蛋白，如circ-FBXW7、circ-SHPRH，而circRNA的编码能力被大大低估甚至忽视了。

近日，麻省理工学院（MIT）Daniel G. Anderson等人在Nature Communications杂志发表了题为：Engineering circular RNA for potent and stabletranslation in eukaryotic cells的研究论文（Article）。该研究开发的工程化circRNA可以在真核细胞中稳定、高效、优质地表达蛋白，开创了外源circRNA在真核细胞中表达蛋白的应用，也证明circRNA是线性mRNA的有效替代品。

真核细胞内源性环状RNA（circRNAs）由于其普遍存在和潜在的生物学功能范围而引起越来越多的关注，在自然界中发现的大多数circRNA是通过反向剪切产生并且似乎履行非编码角色。然而，已经证明果蝇和人类的一些circRNA可以编码蛋白质。

除了具有蛋白质编码潜力之外，内源性circRNA缺乏外切核酸酶介导的降解所必需的游离末端，因此circRNA比线性mRNA更稳定，由于这个原因，环化可以有效解决线性mRNA半衰期短的问题，将mRNA环化，可以在真核细胞中高效、持久地表达蛋白。

成功环化线性mRNA

外源RNA环化有三种一般策略：使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法，使用RNA或DNA连接酶的酶促方法，以及使用自剪接内含子的核酶方法。该研究使用优化的自剪接内含子的核酶方法，结果表明circRNA是这些剪接反应的主要产物，使用琼脂糖凝胶电泳简单有效地分离出环状剪接产物。

可成功环化长达5kb的mRNA

为了进一步提高自剪接前体RNA产生circRNA的效率，在3'PIE剪接位点和IRES之间设计了一系列间隔物，预测允许剪接的间隔序列的添加使剪接效率从46％增加到87％（P1和P2）。 这种改进的构建体，包含同源臂和合理设计的间隔物，能够使接近5kb长度的RNA环化。

环化mRNA成功表达并行使正确功能

研究人员构建了五种不同蛋白质的编码区域，包括Gaussia萤光素酶（总长度：1289nt），萤火虫荧光素酶（2384nt），eGFP（1451nt），人促红细胞生成素（1313nt）和Cas9内切核酸酶（4934nt）。并成功实现这五种RNA序列的环化，但长RNA的环化效率更低。

已经证明内源性circRNA可以产生少量蛋白质。使用RNase R消化每种构建体后转染到人胚肾细胞（HEK293）中。

通过检测发光，Gaussia或萤火虫荧光素酶circRNA的转染导致功能蛋白的大量产生。

同样，转染促红细胞生成素circRNA在细胞培养基中检测到人促红细胞生成素，并观察EGFP circRNA转染的EGFP荧光。

将Cas9 circRNA与针对GFP的sgRNA共转染到表达GFP的HEK293细胞中，与仅转染sgRNA对照相比，在高达97％的细胞中导致GFP荧光消失。

这些结果证实了环化的外源mRNA可以成功翻译为蛋白，并行使正确功能。

HPLC可高效纯化环化mRNA

circRNA的纯度是使circRNA最大化蛋白质产生和避免先天细胞免疫应答所必需的另一个因素。通过HPLC（高效液相色谱）可以高效纯化环化的circRNA。

环化的circRNA比线性mRNA更加稳定

使用HPLC纯化的工程化circRNA，研究人员比较了Gaussia荧光素酶编码circRNA（CVB3-GLuc-pAC）与等摩尔量的经典未修饰的5'甲基鸟苷加帽和3'polyA-tailed线性GLuc mRNA，以及市售的核苷修饰的（假尿苷，5-甲基胞嘧啶）线性GLuc mRNA（Trilink）的稳定性和功效。

circRNA产生蛋白更多：在HEK293细胞中，circRNA比未修饰的线性mRNA多产生811.2％的蛋白质，比修饰的mRNA多产生了54.5％的蛋白质。

circRNA蛋白质产生半衰期更长：在HEK293细胞中，circRNA蛋白质产生半衰期为80h，而来自未修饰和修饰的线性mRNA的蛋白产生半衰期分别约为43h和45h。在HeLa细胞中，circRNA表现出116h的蛋白质产生半衰期，而未修饰和修饰的线性mRNA的蛋白质产生的半衰期分别为约44和49h。