作者：百迈克医学

创伤患者中创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是其中一个主要死亡原因。TBI是外部机械力施加于颅骨和颅内内容物的结果，导致暂时性或永久性认知、身体或心理功能障碍。TBI最显著的特征是其高发病率和死亡率。因此，降低TBI的死亡率和改善其预后已成为医学保健领域的重要课题，神经科学界也越来越关注该领域。目前TBI内部损伤的机制仍不清楚，提高TBI受影响的分子和分子间相互作用以及关键信号通路的理解仍然很重要。

研究表明，外泌体具有许多生物学功能，如信息传递、免疫调节、改变肿瘤微环境等。 随着研究的进展，外泌体越来越受到关注，成为许多研究的焦点。最近研究证实，间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells，MSC）产生的外泌体通过促进内源性血管生成和神经发生，有效改善功能恢复，减少TBI后大鼠的炎症反应。这表明外泌体可能为TBI和其他神经疾病提供新的治疗方法。

环状RNA（circRNAs）是一组非编码RNA分子，形成共价闭合的环，无多聚腺苷酸化的尾巴。共价闭环结构增强了circRNA的稳定性，这使得它们对RNase R的降解具有抗性。 最近的研究表明，一些circRNA可以作为miRNA海绵发挥作用，通过miRNA反应元件调节其他相关RNA的表达水平。circRNAs通过miRNA反应元件与miRNA结合，阻断miRNAs对其靶基因表达的抑制作用。circRNA在外泌体中富集并稳定，circRNA表达改变与疾病发生有关。作者先前研究表明，miR-21可以减轻大鼠TBI后皮质神经元的凋亡和继发性血脑损伤，从而推测TBI脑细胞外间隙外泌体中的circRNA可能在调节基因表达中起重要作用，并调节可能保护大脑的特定信号通路。

02、技术路线

1、实验对象：成年雄性C57BL / 6J小鼠（12-16周龄，22-25克），手术前至少培养7天

2、实验处理：

实验组TBI为液压冲击损伤（fluid percussion injury，FPI）方法得到TBI模型（由摆锤的储层液体活塞通过开颅产生流体压力脉冲完整的硬膜，敲击产生微小位移并使脑组织变形）；

对照组Normal为假手术组，接受了相同的外科手术，但没有接受FPI。

各组12只小鼠，处理后获取脑组织。

3、外泌体环状RNA测序：TBI和Normal各组12只小鼠中4只脑组织随机混样，即最终各组3个样本，分离及鉴定脑细胞外间隙外泌体，构建去核糖体链特异性文库，进行circRNA测序分析。

03、研究结果

1、外泌体鉴定

电镜TEM和Western blot实验用于鉴定获得的外泌体。在TEM下，这些外泌体是直径为30-100nm的不规则球体，具有明确边界且相对完整的膜。Western bolt实验显示，外泌体表达典型的外泌体标志物，例如CD63、TSG101和HSP70。脑组织中没有CD63和TSG101的表达以及HSP70的低表达。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞的标志物，这些外泌体表达GFAP证实它们来自脑组织。在这些外泌体中没有β-actin的表达。

2、TBI脑细胞外间隙外泌体中差异表达circRNA

3个TBI和3个对照脑细胞外间隙外泌体样品的circRNA测序，鉴定了231个显著差异表达circRNA(筛选标准fold change≥2.0且P值≤0.05)。其中155个上调，76个下调，2组间具有不同的表达谱。

3、差异表达circRNA来源基因GO分析和KEGG通路富集分析

生物过程（BP）的GO富集分析显示，差异表达的circRNA来源基因与树突发育、转运、神经系统发育等GO term显著相关。GO细胞组分（CC）富集分析显示这些circRNA与细胞质、细胞器、神经元部分、突触部分、神经元投射等相关。对于GO分子功能（MF），这些circRNA与特定物质如蛋白质、酶、激酶、蛋白激酶、金属离子、阳离子和ATP的结合有关。

KEGG通路富集分析预测了TBI脑细胞外间隙外泌体中circRNA变化影响的途径。上调的circRNAs的前10个途径是谷氨酸能突触、苯丙胺成瘾、催产素信号传导途径、肌萎缩侧索硬化、泛素介导的蛋白水解、FcεRI信号传导途径、钙信号传导途径、B细胞受体信号传导途径和心脏肌肉收缩等。谷氨酸能突触途径在这些信号传导途径中具有最高的富集分数。下调的circRNA的前10个途径是cGMP-PKG信号传导途径、柠檬酸循环途径、甲状腺激素信号传导途径、N-聚糖生物合成、赖氨酸降解、突触小泡循环、肾细胞癌、FcεRI信号传导途径、cAMP信号传导途径和唾液分泌。cGMP-PKG信号传导途径在这些信号传导途径中具有最高的富集分数。上调的circRNA和下调的circRNA的前10个重要途径的途径关系网络显示钙信号传导途径具有重要调节作用。

4、鉴定circRNA-miRNA网络

生物信息学分析表明，一些circRNA可以作为miRNA海绵发挥作用，通过miRNA反应元件调节其他相关RNA的表达水平。 因此，鉴定circRNA和miRNA的相互作用很重要。 本研究鉴定了差异表达circRNA上的miRNA结合位点，并鉴定了差异表达的circRNA的前五个预测的靶miRNA。作者选择33个circRNA和35个miRNA，它们彼此具有非常多的相互作用，以构建circRNA-miRNA网络。该网络显示mmu-miR-883a-3p、mmu-miR-3057-5p、mmu-miR-6980-3p、mmu-miR-6968-5p和mmumiR-9768-3p受更多数量的circRNA调控。

5、qRT-PCR验证circRNA-seq数据的准确性

随机选择5个差异表达的circRNA（chr10:5403841-5426275-、chr8:83937687- 83938400+、chr12:116871936-116901047+、chrX:143709648-143744001+和chr5:115655901-115663886-）进行验证，以GAPDH作为内参进行标准化。除chr8:83937687-83938400+外，所有选择的circRNA均有显著差异（P<0.05）。目标circRNA验证率为4/5，表明circRNA表达谱是可靠的。

小结

首先，本研究证明了创伤性脑组织可以将外泌体释放到脑细胞外间隙。其次，GO富集分析表明差异表达circRNAs可能与神经元的生长和修复、神经系统的发育以及神经信号的传递有关；KEGG通路分析表明最相关的途径主要涉及谷氨酸能突触和cGMP-PKG信号通路，通路整合网络分析表明最重要的核心上游途径是钙信号传导途径。最后，绘制了差异表达circRNA与靶miRNA的互作网络，有助于深入研究特定circRNA作用机制。总之，本研究首次在小鼠TBI后的脑细胞外间隙外泌体中鉴定出一系列差异表达的circRNA，这可能与TBI后的生理和病理过程有关。本研究可以拓宽TBI后的脑细胞外间隙外泌体基因研究的视野，为进一步研究TBI的分子机制和潜在的干预治疗靶点提供新的靶点。

补充：脑细胞外间隙（extracellular space，ECS）是存在于细胞之间不规则的，且相互连通的狭窄空隙，又称组织通道。ECS之间填充着细胞间液（interstitial fluid，ISF），ECS与脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）成分类似，但不同的是ISF中还含有由长链大分子组成的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），它们可与细胞膜附着或完全游离。ECS、ISF和ECM共同构成了脑细胞微环境（brain extracellular microenvironment，BEM）。ECS在保证脑细胞间电信号传导的稳定性，形成细胞与血液之间物质转运通道，以及神经突触重塑过程中发挥关键作用——————大鼠生后发育过程中脑细胞外间隙的解剖及生理特性的变化[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(3): 73-79.

参考文献：Zhao R, Zhou J, Dong X, et al. Circular Ribonucleic Acid Expression Alteration in Exosomes from the Brain Extracellular Space after Traumatic Brain Injury in Mice[J]. Journal of neurotrauma, 2018.