《河南农业大学学报》2018年第52卷第3期刊载了河南农业大学李冰冰 ，王哲， 曹亚兵 ，林丹和范国强的论文——“丛枝病对白花泡桐环状RNA表达谱变化的影响”。该研究由国家公益性林业行业科研专项（201004002）资助。责任编辑蒋国良。

环状RNA （circRNA）作为一类内源性非编码RNA广泛存在于真核生物中，稳定性较强。研究表明，circRNA作为miRNA海绵，可以竞争性地终止其对靶基因的抑制。泡桐是玄参科落叶乔木，原产中国，已有2000多年的栽培史，可供观赏，也可作为绿化和美化环境的行道树种，并可用于航空模型和乐器制作。泡桐丛枝病可造成叶片萎黄，丛枝和枝条枯死，最终导致幼树死亡，大树生长缓慢，蓄材量减少。目前，泡桐丛枝病具体的发病机制仍不十分清楚，circRNA在泡桐丛枝病发病过程中扮演的角色尚未阐明。因此，本研究以白花泡桐基因组为背景，利用RNA-seq技术对白花泡桐进行测序，并筛选出与丛枝病发病相关的circRNAs，为更好阐明泡桐丛枝病的发病机理奠定理论基础。

本研究以河南农业大学林木生物技术实验室培养的白花泡桐健康组培苗和病苗组培苗为材料。总RNA的提取过程及步骤严格按照TRLzol试剂盒的说明书进行操作。按照Illumina公司epicentre Ribo-Zero试剂盒纯化回收rRNA 并片段化， cDNA双链合成纯化使用PCR进行扩增。circRNA 文库构建后使用Illumina Hiseq 4000进行测序。

对测序后获得的原始数据进行处理以获得有效数据 (valid reads)：1) 去除带接头的reads；2) 去除含有N大于5%的 reads；3) 去除低质量的reads。使用TopHat2 (V2.1.0)将得到的valid reads比对到白花泡桐参考基因组上。采用Rse QC软件对RNA测序数据进行整体性评估。对数据组进行UV格式化和平均中心化处理，然后通过主成分分析初步判断差异性。

将有非规范的剪接位点或跨基因的接合读段去除，剩下被用于circRNA的鉴定。本研究使用以下标准进行circRNA的鉴定：1）splice sites两端必须是GU/AG；2）mismatch≤2；3）Back-spliced junctions reads≥1；4）two splice sites (剪切位点) 在基因组上距离不大于100kb。将|2h| ≥ 1 和p value≤0.05作为筛选的标准。对两个文库中产生差异circRNA的基因进行Gene Ontology功能分类和KEGG pathway分析。

利用Targetscan 7.0 (http://www.targetscan.org/)与miRanda软件预测泡桐circRNA的miRNA结合位点。利用Cytoscape 3.4.0软件绘制两者之间的互作网络图。使用qRT-PCR对差异circ RNA的表达水平进行验证。进行Sanger测序以进一步确认反向连接位点的存在。以SKIP作为circRNA的内参基因，数据处理使用2-△△Ct法计算相对表达量。

本研究共鉴定得到1009个circRNAs，其中差异表达的为50个。对差异circRNAs 的host gene进行GO功能分类和KEGG pathway富集分析。其中，GO功能分类结果表明，这些host gene主要涉及叶绿体、蛋白结合、细胞质方面的功能。KEGG代谢通路分析表明他们参与了Plant-pathogen interaction、Glycine, serine and threonine metabolism等代谢通路。

当植物遭受逆境胁迫时，它将进化出复杂的免疫系统。在本研究中circRNA(circRNA112) -hose gene PAU023230.1(LRR-RKs) 参与了植物病原相互作用(Plant-pathogen interaction)代谢途径 (ko04626)，对引发泡桐的一系列防御反应起必不可少的作用。

多个泡桐circRNAs可以靶定同一个miRNA，而多个miRNAs也可以靶定同一个circRNA。对其靶定的miRNA的靶mRNA (PAU014354.1)进行功能注释，其功能主要为编码WRKY 转录因子。因此在泡桐丛枝病的发生过程中有利用泡桐抵御植原体的感染。此外，circRNA-miRNA互作网络图表明circRNAs可以通过竞争性结合miRNAs成为竞争性内源RNA的重要成员之一，作为潜在的转录后调节因子在丛枝病的发病过程中发挥着重要的作用。

通信作者：

范国强，河南农业大学泡桐研究所所长，教授，博士生导师。主要从事森林培育、林木生物技术、泡桐方面的研究。多次到美国、澳大利亚、新西兰、英国访学。现为新世纪“百千万人才工程”国家级人选、国家有突出贡献中青年专家、国务院政府特殊津贴专家、全国优秀科技工作者、中原学者、河南省特聘教授、河南省优秀专家、河南省首批杰出专业技术人才、河南省跨世纪学术技术带头人、河南省科技创新团队带头人、河南省特色学科–林学学科带头人，河南省和国家林业局重点森林培育学科第一学术带头人、中国林业青年科技奖和河南优秀杰出青年基金获得者、河南省师德标兵、河南省文明教师、2015“感动中原”年度教育人物、十三届全国政协委员。以第一完成人获国家科技进步二等奖2项、省科技进步一等奖3项、二等奖5项，授权发明专利2项，获得国家新品种保护权5个，省审泡桐优良新品种8个，制定发布国家林业行业标准3个、省地方标准5个，发表论文162篇（SCI论文47篇），出版著作5部。