原创作者： 小诺 永诺生物

环状RNA VMA21通过靶向miR-200c和X连锁凋亡蛋白防止椎间盘退变

Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein

期刊：Ann Rheum Dis

影响因子：12.35

作者单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院

目的

环形RNAs已经被证实可以作为竞争性内源性的RNAs与microRNAs相互作用，影响miRNA的目的基因mRNAS的表达。本文作者主要研究circRNAs是否可以作为竞争性的内源RNAs来调节椎间盘退变（IVDD）的病理进程。

方法

通过髓核细胞、病人的髓核组织和大鼠模型，研究circVMA21在IVDD的作用及其作用机制。 检测circVMA21和miR-200c、X连锁凋亡蛋白（XIAP）的相互作用。

结果

炎症因子作用的髓核细胞（NPC）和退变髓核组织中XIAP 表达下降，该结果和细胞外基质合成和分解因子的不平衡，以及过多的凋亡直接相关。miR-200c通过抑制XIAP调节NPC的功能和活力。circVMA21作为miR-200c的海绵体，作用于NPC通过作用于miR-200c和XIAP。椎间盘注射circVMA21可减轻IVDD的大鼠模型症状。

结论

CircVMA21可以通过miR-200c-XIAP通路，抑制炎症因子相关的NPC凋亡，缓和细胞外基质合成作用和分解作用的不平衡。提供了一种IVDD的潜在有效的治疗方法。

结果

1、miR-200c在退变髓核组织中上调，参与调节NPC的功能和活力

图1

利用微阵列数据分析退变髓核组织中不同的miRNAs的表达。在2672个miRNA中，有14个miRNA上调（图1-A），用qRT-PCR进行确认，发现miR-200c,miR-130b-5p和 miR-2355–5p与模型相比，表达量明显上调，并且miR-200c上升趋势最显著（图1-B）。在大鼠IVDD模型和病例样本中的趋势与前一致（图1-C）。Northern blot显示miR-200c在退变髓核组织中的表达量也同样上升（图1-D），因此可选用miR-200c做下一步的研究。miR-200c过表达的细胞（图1-E）会增加细胞的凋亡（图1-F），促进caspase活化，促进MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4和ADAMTS-5表达，抑制Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达（图1-G）。在NPCs中miR-200c有促凋亡和代谢的作用。NPCs中的TNF-α 和IL-1β可以增加miR-200c表达量，又可以被miR-200c拮抗剂抑制（图1-H）。抑制miR-200c的表达可以抑制TNF-α 和IL-1β引起的细胞凋亡和细胞外基质的新陈代谢变化（图1-I,J）。这些试验说明miR-200c在负调节NPC细胞的功能作用起关键的作用。

2、miR-200c通过靶点XIAP调节NPC的功能和活力

图2

通过生物学信息的预计，XIAP，调节凋亡的通路，是miR-200c的潜在靶点（图2-A）。GO分析显示退化髓核组织中的上调miRNA和凋亡信号通路之间的关系。wt-XIAP的荧光素酶信号被miR-200c抑制，突变体会减弱miR-200c的抑制作用（图2-B）。XIAP在退变髓核组织中明显下降（图2-C），在NPCs中，miR-200c的上升会引起XIAP表达的下降，抑制内源性miR-200c的表达会引起XIAP的增加（图2-D）。在退变髓核组织中或者miR-200c过表达的细胞中XIAP pre-mRNA没有变化，在NPC中TNF-α 和IL-1β会导致XIAP蛋白的增加，miR-200c拮抗剂则会减弱这种增加（图2-E）。接下来研究miR-200c和XIAP与NPC是否有功能上的联系。结果显示抑制XIAP的表达可以引起细胞的凋亡，加速分解和减少细胞外基质的表达。XIAP的缺失明显抑制TNF-α 和IL-1β的NPC细胞中的miR-200c拮抗剂的作用（图2-F,G)，说明miR-200c通过XIAP起作用。

图3

CCircVMA21是miR-200c的海绵体。在starBase上预测miR-200c有多个circRNAs的结合位点，筛选预测位于前20的circRNA。用qRT-PCR检测髓核组织中circRNA的存在。NP组织中circRNA的结合位置被检测出（图3-A，上）。用扩增引物得到的放大后的产物序列和circVMA21的序列一致（图3-A，下）。退变髓核组织的circVMA21明显下降（图3-B），用FISH验证结果（图3-C）。退变髓核组织中的circVMA21和XIAP含量有关。检测circVMA21是否可以被miR-200限制。在RNAhybrid上比较circVMA21和miR-200c的序列，发现circVMA21包含有6个miR-200c假定的靶点位置（图3-D），其中5个位点可以确定（图3-E）。用qRT-PCR检测NPC中其circRNA、mRNA及其经过RNase R处理过的RNA（图3-F）。Northern blot结果显示线型VMA21可以在结合位点被线型探针检出（图3-G）。miR-200c与被破坏与circVMA21结合位置的miR-200c抑制剂相比，circVMA21明显增加（图3-H）。circVMA21可以从VMA21位置靠后的外显子得到，主要翻译mRNA的3’UTR 。CircInteractome 发现有69个结合位点的蛋白AGO2，交联与免疫沉淀序列表明至少有30个AGO2的结合位点位于VMA21 mRNA的3’UTR区域。其中5个位点与miR-200c重合（图3-I）。AGO2免疫沉淀反应结果表明miR-200c转染的NPC中，被AGO2降低的内源性circVMA2增加（图3-I），表明miR-200c促进了AGO2和circVMA21的联系。Northern blot结果显示circVMA21可以逆转抑制miR-200c（图3-J）。RNA FISH显示circVMA21和miR-200c共定位在NPC的细胞质中（图3-K）。综上所述，circVMA21可以在NPC中直接与miR-200c结合。

3、circVMA21通过作用于miR-200c和XIAP对NPC起调节作用

图4

构建腺病毒circVMA21载体、linear circVMA21载体、circVMA21 siRNA载体和siRNA载体，转染NPC,qRT-PCR结果表明腺病毒circVMA21的转染可使NPC中的circVMA21增加，siRNA可使circVMA21降低（图4-A）。抑制VMA21 mRNA不影响circVMA21的含量水平。同样地，circVMA21 siRNA不影响mRNA水平。Northern blot显示外源性circVMA21的加入可以增加circVMA21的含量（图4-B）。用western blot检测circVMA21对XIAP表达的影响。circVMA21的上调可以增加XIAP的表达量，抑制circVMA21的表达会使XIAP表达下降（图4-C）。同样的变化也出现于ZEB1，miR-200c的一个靶点。此外，circVMA21的上调抵消了miR-200c对XIAP的表达和活性的抑制。总结来说，circVMA21是miR-200c的一个功能性海绵体，可以调节XIAP的表达（图4-D）和活性（图4-E）。接下来研究了在TNF-α 和IL-1β作用的NPC、circVMA21的作用。细胞经过炎症因子处理后，qRT-PCR结果表明在细胞中circVMA21下降，miR-200c上升，当circVMA21上升时，miR-200c下降（图4-F,G）。总的来说，circVMA21可以抑制由炎症因子引起的细胞凋亡和代谢活动，促进Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达（图4-H,I）。接下来检测在炎症因子作用的NPC中，XIAP是否是circVMA21的下游介质。用circVMA21和XIAP siRNA转染NPC,发现当XIAP缺乏时，circVMA21促进NPC活性的作用下降（图4-J,K）。结合所有试验结果，circVMA21通过调节miR-200c和XIAP作用于NPCs。

4、椎间盘注射circVMA21可以减轻大鼠IVDD模型症状

图5

按图示成功用穿刺法建立大鼠IVDD模型（图5-A）。在第一周和第五周穿刺后，人腺病毒circVMA21注射进穿刺过的区域。1、5、9周用X射线照射穿刺的区域。每次注射后，circVMA21组和无注射组或者circVMA21抑制组相比，椎间高度的百分比没有明显差异（图5-B,C）。第9周的注射后，circVMA21注射IVDs组的MRI退变得分明显低于无注射组（图5-D,E）。RNA FISH显示circVMA21位于髓核区（图5-F）。注射腺病毒circVMA21后，退变髓核区的circVMA21含量显著上升（图5-G,H）。circVMA21的注射可减轻髓核的退变，增加大鼠IVDD模型细胞凋亡、分解代谢，减少ECM的合成（图5-I,J,K）。第九周后circVMA21组的组织学的得分明显高于无注射组（图5-L,M）。试验结果表明在体内，circVMA21水平的升高可以抑制NPC的凋亡和ECM的分解代谢，促进髓核组织中的合成和减轻IVDD症状。

总结

图6

在炎症因子作用的NPCs和退变髓核组织中，XIAP表达的下降与NPC细胞的凋亡和细胞外基质代谢和合成的不平衡有关。CircVMA21可以通过作用于miR-200c抑制这些不利因素，因此可以抑制椎间盘退变的发展。因此，CircVMA21可以通过miR-200c-XIAP通路抑制炎症因子导致的髓核细胞凋亡，缓和细胞外基质的代谢合成不平衡，同时也可能是IVDD的有效治疗方法。