作者：百迈客医学

环状RNA（circRNA）已成为非编码RNA领域的研究热点。circRNA作为miRNA海绵，通过竞争性内源RNA（ceRNA）网络抑制microRNA（miRNA），circRNA相关的ceRNA网络可能在许多疾病过程中起关键作用。作为转录后控制的一种新形式，该网络在疾病研究中具有很大的潜在意义。越来越多的证据表明，circRNA在哺乳动物脑组织中高度富集，并且通常来源于神经元功能特异性基因。因此探讨circRNA相关ceRNA网络在神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）中的作用是必要的。

AD是最常见的痴呆形式，其特征在于年龄依赖性记忆丧失和多种认知功能障碍。尽管许多研究试图解释AD的起源，但是在AD临床治疗中开发有效的策略是困难的。然而，AD与circRNA相关的ceRNA网络之间的潜在联系为治疗AD疾病提供了新的线索。据报道ciRS-7可作为竞争性内源性miRNA海绵，抑制AD受累患者大脑中的miRNA-7功能，另有学者绘制了散发性AD（sporadic AD，SAD）新皮质和海马CA1区中ciRS-7-miRNA-7-UBE2A的网络。作者发表文章时，仅有上述2个研究报道，因此认为应该对这个问题进行额外的研究和关注。

NGS材料方法

1、研究材料

• 实验组：快速老化系小鼠（senescence-accelerated mouse prone）8，简称SAMP8，具有与年龄相关的学习和记忆能力的自发性丧失，并且通常被视为重要的SAD（散发性AD）模型。有研究认为SAMP8小鼠在4月龄出现明显的老化体征，6月龄开始表现出空间学习记忆障碍。

• 对照组：生命过程正常的抗快速老化系小鼠（Senescence-accelerated mouse resistant）1，简称SAMR1，广泛用作对照株。

• 购买3月龄上述小鼠，培养至7月龄。

2、全转录组测序

• 3只SAMP8鼠 vs. 3只SAMR1鼠，收集大脑皮层，进行全转录组测序：miRNA-seq & mRNA-seq & circRNA-seq。

• 差异表达miRNA、差异表达miRNA、差异表达circRNA鉴定和qPCR验证

• circRNA相关ceRNA网络构建及GO功能分析

• AD相关ceRNA对筛选分析

研究结果

SAMP8鼠模型的记忆和学习能力评估

1、使用Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）试验评估每组各12只7月龄SAMP8和SAMR1小鼠的学习和记忆能力。定位航行实验（place navigation test）：与SAMP8小鼠相比，SAMR1小鼠的平均逃避潜伏期（寻找到隐藏在水面下平台的时间，用于评估小鼠记忆获取能力）显著降低（p<0.05）。使用空间搜索实验（spatial probe test）来检测对平台空间位置记忆的保持能力：SAMP8小鼠在不知道目标位置的情况下在水池中随机游动，而SAMR1小鼠优先搜索目标象限；与SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠穿越目标象限的次数和在其内花费时间显著减少（p<0.05）。两组游泳速度的无显著差异（p>0.05），这意味着SAMP8小鼠的认知功能障碍不是由于运动和视觉障碍。与相同年龄的SAMR1小鼠相比，7个月大的SAMP8小鼠表现出严重的认知障碍，这与AD患者中观察到的核心临床特征一致。

全转录组测序概述

2、CircRNA-seq：两组6个样本共计225,282,945 clean reads（3个SAMR1为118,620,626，3个SAMP8为106,662,319）,基于find_circ软件检测到34,096个circRNA用于后续分析。

miRNA-seq：6个样本共获得了71,044,988 clean reads（SAMR1为36,446,427，SAMP8为34,598,561）。SAMP8和SAMR1小鼠的比对率分别为约93.67％和93.51％，共计检测到1,298个成熟的miRNA（1,226个已知的和72个新的）用于后续分析。

mRNA-seq：6个样本共计产出599,985,802个clean reads（SAMP8为244,770,474，SAMR1为355,215,328）。SAMP8和SAMR1小鼠参考基因组比对率分别为约85.73％和83.55％。Cufflink鉴定了74,885种蛋白质编码转录本用于后续分析。

差异表达分析

3、相对于SAMR1小鼠，SAMP8小鼠中鉴定了235个显著差异表达的circRNA转录物（p<0.01）：94个上调的和141个下调的转录物；30个显著差异表达的miRNA（p<0.01）：12个显著上调和18个显著下调的miRNA；1,202个显著差异表达的mRNA转录本：716个上调和486个下调（p<0.01）。

qPCR验证

4、用qPCR验证RNA-seq实验中鉴定的差异表达分子，随机选择9种差异表达的转录物：3种circRNA、3种miRNA和3种mRNA。在SAMP8和SAMR1脑中检测以上分子，发现确实组间显著差异表达。总之，在qPCR结果和RNA-seq数据之间观察到高水平的一致性。

构建circRNA相关ceRNA网络

5、ceRNA的成员竞争相同的miRNA反应元件（MRE）以相互调节。本项研究鉴定了SAMP8大脑中的ceRNA网络。作者选择了所有235个差异表达circRNA和1,202个差异表达mRNA并且共享相同MRE结合位点（30个显著差异表达miRNA）。ceRNA网络涵盖两种情况：1种是circRNA（SAMP8小鼠中上调）-miRNA（SAMP8小鼠中下调）-mRNA（SAMP8小鼠中上调），另一种是circRNA（SAMP8小鼠中下调）-miRNA（SAMP8小鼠中上调）- mRNA（SAMP8小鼠中下调）。这些RNA相互作用可能为AD的发病机制提供新的视角。

GO功能注释

6、circRNA相关的ceRNA网络执行功能体现在相关mRNA的功能。GO分析发现这些基因显著富集在159个GO term（校正后p <0.05）。前3个term是细胞内（GO：0005622）、细胞内部分（GO：0044424）和代谢过程（GO：0008152）， 还富集到几个与认知相关的term，例如轴突末端（GO：0043679）、突触（GO：0045202）、神经元投射末端（GO：0044306）、轴突部分（GO：0033267）和长期突触抑制（GO：0060292）。 总之，circRNA相关ceRNA网络从不同角度参与AD疾病进展。

AD相关ceRNA对分析

7、为进一步了解circRNA相关ceRNA网络和AD之间的关系，作者制定了3个筛选条件筛选ceRNA对。首先，选择circRNA、miRNA及其靶基因在SAMP8和SAMR1小鼠之间显著差异表达（校正后p<0.05）；其次，所选择的circRNA、miRNA及其靶基因在小鼠脑中含量应该在一定的数量级；最后，选定的ceRNA对与AD相关联。最终筛选到2个ceRNA对，其中mm10_circ_0027491、mmu_circ_0001293、mm10_circ_0027459、mmu_circ_0000967和mm10_circ_0027483作为ceRNA通过结合mmu-miR-122-5p而调节靶基因Dio2的表达。 AD患者Dio2的表达低于非AD患者， Dio2通过将甲状腺素（T4）转化为生物活性的三碘甲状腺原氨酸（T3）来激活甲状腺激素，激活髓鞘形成。AD中的髓鞘破坏是该疾病的一个显著形态学特征。因此，作者预测上述circRNA相关的ceRNA网络可能参与AD的病理过程。

小结

作者使用全转录组测序分析阐明了SAMP8和SAMR1小鼠的脑circRNA相关ceRNA谱，进一步扩展了对ceRNA生物学的认识，并有助于理解它们在AD发病机制中的调节作用，这些新型网络是AD中潜在的生物标志物或治疗靶标可，能应该为AD的临床诊断、治疗和预防提供有价值的资源。

参考文献：Zhang S, Zhu D, Li H, et al. Characterization of circRNA-associated-ceRNA networks in a senescence-accelerated mouse prone 8 brain[J]. Molecular Therapy, 2017, 25(9): 2053-2061.