作者：自生信草堂|微信公众号

自高通量测序及生物信息学的发展，circRNA被确认为一类新鉴定的非编码RNA，能够作为“miRNA-sponges”参与转录后调控。miRNA是一类通过结合3‘-UTR的种子区(seed region)下调靶基因mRNA的分子，而其本身同样受到体内复杂的调控网络约束。最新研究显示，Cdr1as能够作为一种内源性竞争RNA可以通过MREs结合miR-7。但是在体内, Cdr1as的功能尚待确定，报道首次以circRNA KO小鼠为研究对象，揭开circRNA在大脑中的调控机制。

文章发表于SCIENCE，影响因子41.058。题目为Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function，文献分享将围绕Cdr1as展开，主要内容包括体内与Cdr1as互作的miRNA鉴定，Cdr1as的表达模式，KO小鼠模型的构建及干扰排除，敲除Cdr1as后对miRNA、靶基因及相关表型的影响，并解释为何在Cdr1as KO小鼠中，Cdr1as互作的miR-7下调而miR-671上调现象。这是首次circRNA序列完全敲除的案例报道。
知识累积

Cdr1as是一种环化的长链非编码RNA，在哺乳动物大脑内高水平特异表达且高度保守。在人类中，CDR1as主要定位在细胞质，包含超过70个miR-7的结合位点。作为海绵通过与miR-7部分互补形成复合体，从而使其不能与AGO2结合，降低游离的miR-7分子发挥调控功能。不同于miR-7，Cdr1as 与miR-671则通过完全互补结合的形式结合，可能参与沉默调控Cdr1as，并释放Cdr1as上结合的miR-7。

Cyrano是长链非编码RNA（lncRNA）包含单一、高度保守、几乎完全互补miR-7的结合位点。

PPI（a test of prepulse inhibition）是一种用于感觉运动门控的一种衡量标准，通过低强度预刺激（前脉冲）来检测惊厥反应的正常抑制中的缺陷，常用于神经精神疾病相关的内表型动物模型中。

实验方法概述

1. 使用CRISPR-Cas9技术通过显微注射至单细胞小鼠获得KO小鼠，sgRNA结合位点设计于Cdr1as剪切位点上游。Cdr1as KO菌株在纯C57BL/6N背景上产生并维持。并通过分子和电生理分析及行为研究对比KO小鼠及同窝出生仔WT对照小鼠之间的差异。

2. 新鲜冷冻的脑切片原位杂交（ISH）及免疫染色实验使用固定的核酸探针（locked nucleic acid probes）、通过PCR产物的体外转录获得的RNA及市售抗体。

3. 全细胞电压记录来自于体外第14到17天Cdr1as KO和 WT小鼠海马体神经。

4. 测序文库构建根据Illumina TruSeq流程，测序使用Illumina NextSeq 500 system。

5. miRNA差异基因表达使用程序包DESeq2。

6. 其余实验程序的细节，包含试剂和计算分析，包括支持参考文献，在补充材料的材料和方法详见

www.sciencemag.org/cgi/content/full/science.aam8526/DC1。

与Cdr1as互作的miRNA的鉴定

作者首先通过CLIP-seq方法及对预测的嵌合体 (chimera) 分析鉴定发现，在人和小鼠大脑中miR-7及miR-671靶结合的序列评分最高的为Cdr1as，证实两个miRNA与Cdr1as的互补形式上的差异，并指出结合位点序列具有高度保守性 (Fig. 1A)。同时结果显示miR-7与lncRNA Cyrano (1700020I14Rik)互作得分仅次于Cdr1as，暗示Cyrano可能同样参与miR-7的调控。

小鼠大脑中Cdr1as的表达模式探索

作者通过使用神经标记物下的RNA荧光原位杂交（FISH）实验验证Cdr1as在大脑中的表达模式。结果显示Cdr1as在兴奋性神经元中高水平表达，但在神经胶质细胞如少突胶质细胞和星形胶质细胞中不表达；在皮层，海马，中脑和后脑中，神经元VGLUT1和VGLUT2均表达Cdr1as (Fig. 1B)。而在原代皮层神经元中的单分子RNA FISH实验中，Cdr1as 在胞体及轴突中均有表达，暗示其在不同的亚细胞定位中能够发挥调控功能 (Fig. 1C, left)

KO小鼠模型

作者KO采用的方法为CRISPR-Cas9技术，因此首先对反义链转录干扰问题进行探索。作者针对小鼠大脑的4个区域构建了24个链特异性RNA文库并测序，通过设计Cdr1 mRNA 互补探针的原位杂交(ISH)，并结合RNA数据、表达基因的cap信息及染色质修饰数据进行分析，结果显示Cdr1as与反义链转录本间并无联系。随后作者通过genotyping, ISH (Fig. 1D), Northern blot analysis验证Cdr1as的敲除，并通过qRT-PCR进行定量验证KO情况，最终获得成活、具有生殖能力且脑部解剖中没有出现异常KO小鼠。

由于Cdr1as与X染色体关联，因此作者通过定量验证了敲除小鼠在雄性和雌性中的差异，结果显示野生型雌雄个体的Cdr1as 表达一致，而在杂合子雌性小鼠中，Cdr1as 表达较野生型水平降低一半，因此作者使用敲除后的雄性小鼠作为后续分析对象。

Cdr1as KO对miR-7和miR-671的影响

首先作者通过对Cdrlas在大脑中高表达的四个区域（小脑、皮质层、海马体和嗅球体）miRNA测序数据比较miR-7在野生型及KO小鼠间的表达差异，结果显示具有相同前体而形成不同成熟体的miR-7a-5p 和miR-7b-5p在所有的样本中均下调，并具有高度保守性。在所有鉴定的miRNA中，除miR-7a-5p、miR-7b-5p外仅有8个miRNA显著下调，但是该现象只出现在皮质层中。其次通过Northern blot (Fig. 3A), ISH (Fig. 3, B and C), qRT-PCR分析及测序数据分析证实在四个大脑区域中确认miR-7下调且调控转录后过程。不同于miR-7的表达，miR-671-5p KO小鼠大脑的小脑、皮质层和嗅球体三个区域中表达上调，且高度特异参与转录后调控。

随后作者对非脑组织 (肺，骨骼肌，脾脏，心脏和脊髓) 中,Cdr1as敲除后miR-7及miR-671 水平的变化，只有在脊髓中实质上改变了miR-7的表达，且只有脊髓中的Cdr1as表达与神经元中一致。

Cdr1as KO对靶基因的影响

通过对大脑四个区域的mRNA测序分析，作者得到敲除Cdr1as 后对靶mRNA的影响。miR-7靶基因包括Fos 、Nr4a3 、Irs2 及Klf4 在cortex, cerebellum, and olfactory bulb 中显著下调（Fig. 4, A to D)。miR-7是细胞周期及IEGs例如Fos基因的调控抑制子，且IEGs与与神经元活动增加密切相关，因此作者通过qRT-PCR assays、Nanostring首先对测序数据真阳性进行验证，Western blots (Fig. 4E)及进一步的免疫组化 (Fig. 4F)验证c-Fos and EGR1蛋白在大脑各个区域的表达发现，在KO大脑中，c-Fos蛋白显著被抑制。

在KO小鼠的非脑组织中，IEGs的表达水平并没有改变，因此Cdr1as 表达是大脑特异的。除了IEGs外，在KO小鼠中一些生物钟基因如Per1 and Sik1 始终上调，Dbp始终下调，这些在前脑区域表达与小鼠睡眠剥夺和延长清醒时间有关。

Cdr1as KO对突触兴奋传递功能的影响

随后作者通过对单个海马神经元兴奋性突触后电流的研究 (EPSCs) 来判断Cdr1as KO小鼠兴奋性突触传递功能障碍。在二倍EPSC频率(Fig. 5A) 而不改变振幅的情况下，自发囊泡释放强烈上调。通过钙诱发的突触反应，Cdr1as KO的神经元EPSC振幅没有显著改变(Fig. 5B, left)，且囊泡释放的概率及大小没有显著改变，较高的自发释放并不依赖于突触形成或者囊泡发生。这些电生理学记录表明Cdr1as敲除能够导致兴奋性突触传递功能障碍。

Cdr1as KO对神经精神类行为的影响

观察发现，Cdr1as KO小鼠表现出正常的社交行为，未受影响的焦虑水平，在开放式野外测试中KO小鼠运动活动未受干扰，识别记忆或探索行为也无明显缺陷。但对惊恐反应的前脉冲抑制（PPI）的测试中，三种前脉冲强度下WT和Cdr1as与KO小鼠（雄性和雌性）之间的显著且强烈的差异（30-50％）(Fig. 5C) 。

实验数据显示Cdr1as KO动物表现出与神经精神疾病相关的行为表型，即强烈的感觉运动门控缺陷。而Fos、IEGs等与神经元活动增加密切相关，因此Fos，Egr1和Egr4等IEG的上调与PPI降低有关。

讨 论

1. 作者使用CRISPR / Cas9技术首次完全删除circRNA的全长序列获得敲除小鼠，可能还是存在着一些尚未解决的问题：

a. 反义链干扰

虽然已验证了反义链无法转录出Cdr1as，但是完全敲除Cdr1as基因座所带来的影响可能并不仅仅导致Cdr1as KO，即Cdr1as可能能够转录出其他不同的转录本。

b. 脱靶效应

目前没有直接的证据排除脱靶效应，但是作者通过几项观察到的分子和行为表型反向论证，大致如下：

（1）Cdr1as相关的miRNA表达皆出现变化；

（2）早期基因（Immediate early genes, IEGs）包含miRNA-7的靶基因在突变体大脑中上调，但是在其他组织（Cdr1as表达很低）并表现上调；

（3）这些IEG与观察到的神经精神症状-前脉冲抑制受损（PPI）有关；

（4）Cdr1as仅在神经元而非神经胶质细胞中表达，表明Cdr1与miRNA的相互作用在神经元中起作用，因此与观察到的PPI缺陷和突触传递功能障碍一致。

2. Cdr1as 作为ceRNA在KO模型中的表现与预测不符

首先作者推测这是由于Cdr1as序列上存在两个miRNA的结合位点，且两者在Cdr1as上的结合位点不同。作者推测由于lncRNA Cyrano促进和调节所导致的，原因如下：(1)嵌合物分析流程中，Cyrano是评分第二高的miR-7相互作用物；(2)Cyrano在表达Cdr1as的所有组织中都很好地表达；(3) Cyrano上的miR-7结合位点类似于Cdr1as上的miR-671结合位点，具有极其保守的结构。

3. Cdr1as敲除后对immediate early genes (IEGs)的影响

IEGs 的上调包含Klf4, Nr4a3 and Irs2基因，虽然都为miR-7的靶基因，但是不足以解释这些基因的大量上调的现象，在其他报道中，敲低Cdr1as后HEK293细胞中miR-7靶标被抑制。作者认为，组成型的Cdr1as被敲除时，miR-7分子不能被circRNA稳定时极可能出现反转现象，即导致miR-7靶基因上调。同时miR-671可能通过sponged miR7:AGO 复合物在特定的条件下切割Cdr1as，从而调节miR-7及靶基因。

小 结

作者首次以circRNA完整序列KO小鼠模型为研究对象，CRISPR / Cas9技术应用于circRNA编辑具有很高的参考价值。并最终得到如下结论：（1）在机制上，Cdr1as调节miR-7在神经元中的稳定性或转运，而miR-671通过调节Cdr1as水平调控miR-7水平。（2）在功能上， Cdr1as及其与miRNA的直接相互作用参与感觉运动门控和突触传递关键过程。同时作者发现了几个有趣的现象，如KO小鼠大脑中同时出现了生物钟调节基因失调，以及差异表达的miR-200家族和IEG都与癌症相关，深入研究对癌症模型的构建可能具有极大意义。

参考文献：Piwecka Monika, Glažar Petar, Hernandez-Miranda Luis R et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function.[J] .Science, 2017, 357(6357).