原创作者|古月湖人、吉赛生物|www.geneseed.com.cn

Ribonuclease R (RNase R)是一种核糖核酸外切酶，广泛应用于circRNA的鉴定、富集和相关实验。笔者注意到很多研究人员在使用中碰到了一些问题和“奇怪”的现象，下面就来简单的梳理一下，并在参考文章和资料的基础上给出解释和建议。

1 RNase R的功能

RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，可以从3’-5’方向切割降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子（Cheng ZF et al., 2002）。

图1 RNase R消化RNA示意图（吉赛生物）

2 RNase R的反应体系

关于RNase R的具体使用量和反应体系，不同参考文章里也有差别，常见的为10 μL或20 μL反应体系，使用比例为3U RNase R/μg RNA，下图是一个推荐的反应体系。

图2 RNase R消化反应体系（吉赛生物）

3 什么时候用？

RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和目的来决定是否进行RNase R消化。

3.1 circRNA的鉴定

circRNA的鉴定常使用RT-PCR（图3, 4）和Northern blot实验（图5，6），根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是circRNA。

图3 使用RT-PCR检测mRNA，在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）

图4 RNase R消化后分别以Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA样品。RNase R(+)中Divergent Primer有条带，Convergent Primer无条带；RNase R(-)中Divergent Primer和Convergent Primer都有条带，表明检测的基因为circRNA，并且耐受RNase R消化（Yibing Y et al., 2018）

RT-PCR中若要证明检测的基因是否为circRNA，需要体现在RNase R(+)和RNase R(-)组中条带有无和丰度高低有差异，这种情况是需要做RNase R消化的，也可以和分别使用Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA和gDNA样品的结果结合起来。如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化），因为Divergent Primer和Convergent Primer基本可以保证检测的特异性。

图5 以3U RNase R/µg RNA 进行RNase R消化15分钟，电泳显示RNase R(+)组中28S/18S条带变淡。使用同时检测circRNA和mRNA的探针进行Northern blot实验，结果显示RNase R(+)组检测不到线性的Gapdh、Phf21a、Elf2、Mfsd6、Stau2或Zfp609，可以检测到对应的circRNA，表明mRNA被消化，而circRNA耐受消化（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）

图6 RNase R消化产物电泳显示RNase R(+)组中28S/18S/5S条带变淡。Northern blot检测显示RNase R(+)组中无线性GAPDH的条带，CDR1as和hsa-circRNA 2/3/16能检测到条带，表明线性RNA被消化，而circRNA耐受消化（Memczak S et al., 2013）

Northern blot实验使用探针特异性检测内源的circRNA和线性RNA，过程中无PCR扩增，能够真实地反映circRNA和线性RNA的定性定量分析结果，是circRNA鉴定中必不可少的一个实验。

3.2 circRNA的富集

高通量测序时常需要对circRNA进行富集，此时RNase R消化就是必须的。为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。笔者实验室的测序显示RNase R(+)组中junction reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs。

图7 RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014）

4 RNase R消化的效果

Total RNA经消化后直接进行电泳检测，RNase R(-)组中28S/18S/5S三条带单一明亮，而RNase R(+)组中28S/18S/5S条带会变淡或不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）。但如果RNase R+组中5S条带加亮，且28S/18S条带处有拖尾，则可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化产生的，如不能确定降解是发生在电泳过程中还是RNase R消化反应中，可以尝试在RNase R消化反应体系中加入RNase inhibitor。

图8 a, RNase R消化后条带变淡；b, RNase R消化后条带不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）

5 实验细节和常见问题

5.1 测量浓度

实验中要先对total RNA测量浓度，以计算相应的比例和使用量来进行RNase R消化。消化后的产物无需测量浓度，实际上因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分影响，测量到的浓度也不会准确。

5.2 纯化回收

经RNase R消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA纯化柱和磁珠进行纯化回收。经RNase R消化后直接进行RT-PCR的，一般可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可（Legnini I et al., 2017; Guarnerio J et al., 2016）。

注：苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V）溶液最好现配现用，没有试剂也可以Trizol Reagent代替。

5.3 RNase R消化反应温度和时间

RNase R消化一般于37℃进行反应，时间10-30 min为宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能也需要摸索反应时间，笔者实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。

经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（Cheng ZF et al., 2002）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做酶的失活。

5.4 qPCR定量计算

RNase R消化后不能再使用ACTB或GAPDH作为内参，此时可以将原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（RNase R(+)），另一份不处理（RNase R(-)），统一以RNase R(-)组中的内参为计算标准（Zhang Y et al., 2016）。

另外在RNase R消化后如果进行纯化回收，RNA的浓度可能会有变化，不适宜再以RNase R(-)组中的内参为计算标准。此时可以在纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Pamudurti NR et al., 2017）。

5.5 circRNA也被消化？

实验中有时会发现经RNase R消化后部分circRNA丰度也有明显降低，此时要检查消化反应体系有无问题，考虑是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA在经长时间RNase R消化也会丰度降低，可能是因为其耐受RNase R消化力弱（Zhang Y et al., 2016）。

图9 RNase R消化0-120 min，检测circCAMSAP1在15 min时就被明显消化（Zhang Y et al., 2016）

图10 RNase R消化后进行qPCR检测，RNase R组中has-circRNA 2/3/6/9/16和CDR1as丰度有轻微降低，但和GAPDH相比，circRNAs显示有不低于10倍的耐受RNase R消化力（Memczak S et al., 2013）

笔者实验室也经常会检测到RNase R消化后circRNA丰度会降低的情况，一般缩短消化时间可以减少circRNA被消化的可能，另外对比线性RNA和circRNA消化后丰度降低的倍数，是明显能看到circRNA比线性RNA耐受消化的。

参考文献：1. Cheng ZF, Deutscher MP. J. Purification and characterization of the Escherichia coli exoribonuclease RNase R. Comparison with RNase II. Biol. Chem. 2002; 277:21624–21629.

2. Rybak-Wolf, A. et al.. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Mol. Cell. 58, 870–885 (2015).

3. Yibing Yang et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3).

4. Suzuki H et al.. Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing. Nucleic Acids Res. 2006; 34(8), e63.

5. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al.. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013;495(7441):333–338.

6. Jeck WR, Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014; 32:453–61.

7. Guarnerio J, Bezzi M, Jeong JC, Paffenholz SV, Berry K, Naldini MM et al.. Oncogenic Role of Fusion-circRNAs Derived from Cancer-Associated Chromosomal Translocations. Cell. 2016 Aug 11;166(4):1055-1056.

8. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, Fatica A, Santini T, Andronache A, Wade M, et al.. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol Cell. 2017;66(1):22–37.e29.

9. Zhang, Y., Yang, L., and Chen, L.L. (2016c). Characterization of Circular RNAs. Methods Mol. Biol. 1402, 215–227.

10. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017 Apr 6;66(1):9-21.e7.