原创作者：美格基因|微信公众号

研究背景

壹

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinomas, LSCC）是源自喉粘膜上皮组织的恶性癌。它是一种侵袭性的头颈部肿瘤，每年在全球所有新发恶性肿瘤中占约2.4％；出现转移性后，5年死亡率超过50％。此外吸烟和过量饮酒等多重因素有助于LSCC的发展。虽然过去十年来LSCC的研究有了长足的进步，但其病因和发病机制仍不清楚。

环状RNA（circRNA）作为与癌症相关的分子生物标记物，是癌症预防检测和靶向治疗的一个新的解决思路。本研究采用二代高通量测序，鉴定了与LSCC相关的circRNA，并进一步预测出circRNA-miRNA-mRNA 共表达调控网络，为研究LSCC的发病机理奠定基础。

实验设计

贰

从医院采集的10个经病理学确诊的组织样本：5个为LSCC组织样品（3个高度分化、2个中度分化），5个为LSCC病灶相邻的健康组织，液氮速冻、-80℃保存。

提取样品总RNA，一份用于去除DNA、线性RNA后制备RNA-seq小片段文库，基于Illumina HiSeq 3000平台测序；一份用于RT-qPCR。

测序数据分析：计算circRNA表达量，找出差异表达circRNA，并进行qPCR验证；结合临床特征，缩小差异表达circRNA的数量；最后基于circRNA-miRNA-mRNA调控网络分析，信号通路KEGG富集分析找出与LSCC密切相关的代谢通路。

实验结果

叁

01. LSCC样本中circRNA的鉴定和表达聚类

测序结果共检测到21444个circRNA，其中约85%的reads来自于基因组外显子区域（图1a）。对所有circRNA进行表达量和差异表达（|log2(fold change)| > 1, q-value < 0.05）计算后，共找到48个circRNA与LSCC有关，与正常组织相比，在LSCC组织中29个表达显著上调，19个表达显著下调。结合组织临床特征，最后把范围缩小到18个上调circRNA，5个下调circRNA（图1d, e）。

图1. 来自LSCC样品的差异circRNA谱的测序信息

02. 构建circRNA和miRNA网络和功能分析

通过软件预测到与20个circRNA相关的miRNA（其中3个预测结果不可靠去除），取前五名候选miRNA，使用Cytoscape 构建circRNA-miRNA互作网络图（图2a）。

对miRNA的靶基因进行GO 和KEGG功能预测，发现circrRNA主要调控的过程有生长发育、细胞调控和细胞连接，可能影响的代谢通路有MAPK、PI3K-Akt以及Ras等（图2b）。

图2. a. LSCC中circRNA-miRNA互作网络图；b. 20个circRNA互作的miRNA及其靶基因相关KEGG显著富集途径气泡图

03. 与癌症相关circRNA和miRNA的挑选

通过KEGG富集分析中癌症信号通路相关的miRNA，绘制了癌症相关的circRNA-miRNA互作网络图（图.3a），最后挑选了排序最高的3个circRNA作为LSCC潜在分子标记，进行后续分析。

04. 三个circRNA在LSCC中作用方式探索

三个circRNA的癌症相关miRNA数量分别为151、112和208，有9个miRNA是共有的（Fig.3b），对miRNA靶基因的KEGG功能分析，发现PPAR、Axon guidance、Wnt、细胞循环等代谢途径是LSCC的病理过程中的重要信号通路（Fig.3c）。

通过qPCR的验证，发现circRNA（hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648）在肿瘤组织和正常组织中的表达差异显著，可作为后续LSCC研究的分子标记（Fig.3d）。

图3. a. circRNA-miRNA关联的预测; b. 三种候选癌症相关的circRNA调节的9种常见miRNA韦恩图; c. 9种miRNA的靶基因的KEGG信号传导途径; d. Q-PCR鉴定的LSCC组织中hsa_circ：chr20：31876585-31,897,648的下调

结论与亮点

肆

本文是基于circRNA-miRNA-mRNA关系分析与LSCC密切相关的circRNA表达变化的首次研究，结果鉴定了与LSCC发展密切相关的3个circRNA分子标记。总之，喉鳞状细胞癌的转录组高通量测序和生物信息学分析为该疾病的未来研究提供了有用的诊断标记和潜在的治疗靶点。