转自生信草堂|  原创： 土豆力

本篇为植物 circRNA 系列文献阅读第五篇，模式植物拟南芥 circRNA 数据型文章第三篇。 今天分享的文章题目为：Heat stress alters genome-wide profiles of circular RNAs in Arabidopsis，文章链接为 http://dx.doi.org/10.1007/s11103-017-0684-7

背景：

1. 环境温度波动是影响植物稳定产量的主要威胁之一。过去几十年里，全球气候加剧变化，热胁迫导致作物的产量严重下降。

2. 大量研究表明，植物对热胁迫的响应主要通过热休克蛋白和热休克因子（heat shock proteins and factors）、活性氧化物(ROS)，磷脂途径及植物激素途径完成。

3. 大量的非编码RNA同样活跃在热胁迫过程中，比如拟南芥中，miR400, miR398, miR156；此外，高温抑止了SGS3（SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3）介导的siRNAs的生物发生，并导致转录后基因沉默；拟南芥tasiRNA TAS1(trans-acting siRNA precursor 1)能够抑止通HSFA1a介导的途径调节植物耐热性的HTT1和 HTT2基因(HEAT-INDUCED TAS1 TARGET 1) 的转录；而反义lncRNA能够抑止HSFB2a基因的表达，影响高温下配子体发育。

材料与方法：

1、材料

将萌发后一周野生型拟南芥(ecotype Columbia-0)分为两组，38℃处理3小时后，收集各组苗(n>40 for each) 用于建库测序分析，Illumina Hiseq 4000，PE150。

2分析流程

a. TopHat version2.1.1用于map到参考基因组，切分读段的平均大小为25bp；未映射上的读段使用Bowtie重新比对，获得一系列包含一个及以上剪切的接头的片段。

b. STAR用于找寻circRNA-seq数据中的反向剪接读段，参考基因组选用拟南芥(tair10)。

c. CIRCexplore2用于circRNA的鉴定，鉴定的候选者需要同时满足以下两个条件：（1）至少出现两个区分的读段（3个样本中）支持环状RNA接头鉴定。（2）非经典剪切信号用于鉴定circRNA时，需要三个区分的读段。

d. DESeq R packages用于差异表达分析，Padjust <0.01，topGO R packages用于差异基因的GO富集分析。

e. circRNA‑associated‑ceRNA预测，首先预测miRNA的靶circRNA和靶基因，并检验可信度。满足条件如下：（1）miRNA同时包含以上两种靶位点；（2）circRNA和基因在DEG分析中应该具有相同变化趋势。并进行Fisher检验。

3、PCR及qRT-PCR实验

结果：

1、热胁迫下circRNA的特征描述

通过测序，处理组及对照组分别获得43.5 million (Heat)、 55.6 million (Control) clean reads，总共鉴定得到2165个circRNA，与已有数据库比较，1599个circRNA为新鉴定的circRNA。其中94个circRNA同时在两组中表达。随机选择了25条circRNA通过PCR扩增实验验证，其中19条（76%）序列被验证。

作者从以下几个角度分析热胁迫对拟南芥circRNA表达的影响：

a. 对比两组数据，处理组中鉴定的circRNA远远大于对照组（fig.1b），染色体定位分析发现处理组的circRNA 拟南芥5条染色体上具有较大差异，但是在叶绿体及线粒体基因组上circRNA的丰度并没有特殊变化（fig.1c）。

b. 来源统计发现，外显子circRNA数量和比例上都有明显的提高，而基因间circRNA虽然数量上提高但是所占的比例下降，其余两种circRNA并没有太大的改变（Table 1）。长度和外显子circRNA中外显子的数量统计对比分析，在热激下，拟南芥中circRNA序列的长度明显增加，而单个circRNA包含的外显子数量处理组中最多包含14个，对照组为9个（fig.3b）。

c. 可变反向剪切是circRNA多样性的主要原因，能够通过different exons (Diff_Exon), overlapping, same end, same start, within, and skipped exon六个维度来描述来源于同一基因的circRNA的可变剪切。野生型拟南芥94%的circRNA没有亚型（single），但是在热激下该比例降到了74%（fig.4）。但是，两者间线性mRNA可变剪切类型的分析并没有得到热激与外显子环化及跳跃有直接联系。

2 、差异表达

首先作者通过随机挑选20个差异表达的转录本通过qRT-PCR验证测序数据的表达水平分析，GO富集分析显示，多个亲本基因在热应激及蛋白折叠上发挥着重要作用。随后作者根据筛选条件：如果在热处理下circRNA和其亲本基因同时上调或者下调，可以被认为是一个 “positive” case，比较得到308对（70%），其中50%的亲本基因差异达到2倍。

3、ceRNA网络构建

根据靶基因的预测及DEG分析，作者挑选了在热应激下circRNA和基因具有相似表达的模式的ceRNA 对构建网络图。这些目标基因参与植物对热，过氧化氢，水杨酸，乙烯和其他与耐热性相关的途径的反应。

小结：

文章通过鉴定对比热处理下的拟南芥转录组测序结果，获得一批新鉴定的特有circRNA。PCR扩增及qRT-PCR验证数据真实性后，对两组样本中circRNA长度、外显子个数以及剪切事件分类分析，热胁迫下circRNA的表达存在明显差异，随后通过miRNA的靶circRNA及靶基因预测，构建ceRNA网络图，拟说明circRNA在热胁迫过程中发挥了重要作用。