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”金桂飘香，秋风送爽“，舒爽的秋风充盈着收获的芬芳，而全长环状 RNA 领域也新晋一位成员 —— 近日，北大医学部基础医学院的杨恩策研究员率领自己的团队开发了Nanopore 定量全长环状RNA新的实验策略和生物信息学方法，并将成果分享到了 eLife 上。
文章简介
继 isoCirc、CIRI-long、circNick-LRS，circFL-seq 已经是今年第四篇用 Nanopore 测序方法检测全长环状 RNA 的策略。
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circFL-seq 在实验上采用了和 CIRI-long 相似的策略，即滚环反转录（rolling circular reverse transcription, RCRT）扩增 + Nanopore长度长测序，既保证了测序能够覆盖环状 RNA 全长，又解决了三代测序序列质量较低的问题；同样，在生信方法上，circFL-seq 与 CIRI-long 都通过 BSJ(backspliced junction) 来确定 circRNA，并用 CSS(cyclinc concensus sequence) 准确解析 circRNA 全长。当然，两者仍存在一些细节上的差异。例如，实验策略上（图1），
•circFL 在滚环反转录之后会加 poly(A) 尾，随后通过加引物接头对滚环序列进行扩增
•CIRI-long 在滚环反转录中同时在 cDNA 两端加接头，然后再进行扩增
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同时，作者将 isoCirc、CIRI-long 与 circFL-seq 进行了对比，如下表 1
可以看到，三种策略各有千秋，至于哪种效果更好，可能还需要结合具体需求从实践中见真章。新策略新特征
环状 RNA 结构和功能研究都离不开对其全长序列的解析，例如•环状 RNA 通过序列与 miRNA 互补，作为 ceRNA 调控 mRNA 分子的稳定性或丰度•环状 RNA 序列中包含 RBP 的结合 motif，参与各种生命活动
•环状 RNA 序列中可能具有 IRES 元件，可以翻译成多肽或蛋白质发挥功能
circFL-seq 除了能够比较准确地捕获 circRNA 全长以及可变异构体（如图2 准确地识别到了 CDR1as 的两个异构体）还发现了一些新的特征。
作者根据基因组特征将 circRNA 分成了 7 类（NSS，novel splicing site），如图 3 展示了这 7 类 circRNAs 的一些特征，包括包含的 isoforms 数量、序列长度、外显子数量等。
•绝大多数外显子（99.8%）环状 RNA 都被注释过（图 3 C）•全长环状测序显示 circRNA 的中值长度是 400 ~ 600nt，也就是说很多 > 500nt 的 circRNA 并不能被二代测序检测到（图 3 D）•read through 通读环状 RNA 包含更多的外显子 （图 3 E）
•单个外显子环状 RNA 的外显子明显比多外显子长（图 3 F）
全长环状 RNA 测序识别可变剪切事件具有天然优势，文中主要介绍了四种事件（图 4 G），包括•ES(exon skipping ) 占比 44.3%•A3SS(alternative 3' splicing site) 28.1%
•A5SS(alternative 5' splicing site) 24.1%
•IR(intron retetion) 3.5%
相比 isoCirc 与 CIRI-long， circFL-seq 识别到了更多可变剪切事件
融合环状 RNA （f-circ, fusion circRNA）被发现在癌症中扮演着非常重要的角色，包含两个 fusion junctions（一个属于 fusion gene，另一个是 back-spliced fusion）然而，短链的 RNA-seq 难以准确捕到 f-circ。但 Nanopore 长读长这一天然优势让鉴定f-circ 变得容易了，如图 5，作者发现了两个 antisense 基因的 f-circ。
另外，目前f-circ 的验证方法只适用于已知的 fusion gene junctions，那些未知的基因融合事件往往被遗忘了，而通过 circFL-seq 或其他全长环状 RNA 测序，我们可能会对 f-circ 有新的认识。
circFL-seq 为全长环状 RNA 鉴定以及转录异构体的定量提出了新的实验策略与生物信息学方法，相比之前的策略，作者评估该方法在可变剪切以及 f-circ 鉴定上具有更大的优势。
Liu Z, Tao C, Li S, et al. circFL-seq reveals full-length circular RNAs with rolling circular reverse transcription and nanopore sequencing[J]. eLife, 2021, 10: e69457.
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